Melidava

Zeolit natural clinoptinolit: nou adjuvant în terapia anticancer

Natural zeolite clinoptinolite: new adjuvant in anticancer therapy

Pavelic, M. Hadzija, L. Bedrica, J. Pavelic, I. Dikic, M. Katic, M. Kraj, M. H. Bosnar, S. Kapitanovic. M. Poljak-Blazi, S. Krizanac, R. Stojkovic, M. Jurin, B. Subotic, M. Colic

Journal of Molecular Medicine feb. 2001

NOTA: in text o sa gasiti frecvent abrevierea MZ, adica micronized zeolite, adica zeolit micronizat (macinat f.f. fin)

In loc de concluzii: efectele benefice ale zeolitilor naturali in oncologie sunt cunoscute si studiate de 50 de ani. Mai jos o sa gasiti traducerea unui studiu edificator realizat acum 20 de ani. De ce nu exista nici o preocupare din partea medicinei alopate pt acest produs?

Autorii articolului spun cu modestie ca: „am studiat efectul particulelor de clinoptinolit natural asupra dezvoltării unor modele de cancer in vitro și in vivo. Am găsit că zeolitul clinoptinolit activat mecanic acționează ca agent terapeutic în studii in vivo pe animale și în culturi model de celule.Clinoptinolitul aplicat oral  la șoareci și câini suferind de diferite tipuri de tumori determină micșorări ale unor tumori și îmbunătățirea stării generale de sănătate la unele animale.”

UE face tot posibilul sa interzica sub o forma sau alta acest produs, sau sa limiteze utilizarea lui pe cat posibil.

Sunt destui care se plang pe unde pot ca „X”, prieten, ruda, a utilizat zeolit si tot a murit. Daca ati cumparat de la cine stie ce magician al vorbelor, da, va cred si va inteleg. Da` nu va da prin cap sa nu cumparati de pe prima pagina pe care o deschide Google, sa cercetati sa vedeti, pe langa cutii colorate si vorbe sforaitoare exista oare si o competenta reala? Altfel sunteti complici la acest insucces, cu atat mai mult cu cat aveti unii dintre Dvs obiceiul de a sta 4…6 ore zilnic pe Internet. Oare nu s-ar putea ca acest timp sa fie proportional si consumat de o maniera utila pt a va informa din mai multe surse?

………………………

Introducere

Zeoliții sunt cristale microporoase hidratate, naturale și sintetice, cu structuri bine definite, care conțin tetraedre de AlO₄ și SiO₄ legate prin atomi comuni de oxigen. Au fost folosiți extensiv în diferite aplicații industriale datorită proprietății lor de a acționa drept catalizatori, schimbători de ioni, adsorbanți și componente ale detergenților. Se știe că silicații și aluminosilicații prezintă activitate biologică, pozitivă sau negativă. Talcul și silicea au fost folosite pentru îngrijirea pielii de zeci de ani, iar structurile bine definite și activitatea catalitică fac din aluminosilicați modele care pot imita proteine și enzime. Clinoptinoliții naturali, nontoxici, din depozite din Cuba, sunt eficienți ca adsorbanți de glucoză, fiind considerați ca posibile medicamente pentru persoanele care suferă de diabet zaharat.

Cea mai cunoscută activitate biologică a clinoptinolitului natural este acțiunea sa drept medicament antidiareic. Clinoptinolitul micșorează decesele și sindromul diareic produs de bolile intestinale la porci, șobolani și viței. Au fost efectuate studii asupra medicamentelor antidiareice pe bază de clinoptinolit drept componentă activă în tratamentul diareei acute la oameni și a fost aprobat medicamentul Enterex de uz uman. Zeoliții au un rol important în reglarea sistemului imun. Ueiki et al. și Aikoh et al. au comunicat că silicea, silicații și aluminosilicații acționează drept imunostimulatori nonspecifici, similar cu superantigenii. Superantigenii sunt o clasă de imunostimulatori și proteine bacteriene sau virale, cauzatoare de boli, care pot activa fracții relativ mari (5 – 20%) din populația de celule T. Activarea necesită interacțiunea simultană a superantigenilor cu domeniul Vβ al receptorilor celulelor T de histocompatibilitate majoră, molecule complexe de clasa II de pe suprafața celulelor prezentatoare de antigeni. Macrofagii proinflamatori, care aparțin de moleculele MHC de clasa II prezentatoare de antigeni, sunt activați de particulele fibrogenice de silicați. Ueki et al. au arătat că îndepărtarea celulelor pozitive DP/DR MHC de clasa II determină lipsa stimulării macrofagilor de către azbest. Au fost identificate și descrise interacțiunile directe ale particulelor de silicați cu celulele, altele  decât limfocitele. Se pare că particulele minerale pot produce modificări ale expresiei genelor prin inițierea de evenimente de semnalare în amonte de transactivarea genei. Expunerea celulelor la particule de silicați determină activarea proteinkinazelor activate de mitogen  (MAPK), protein kinazei C și a proteinkinazelor activate de stres. Factori importanți de transcripție precum proteina activator 1 și factorul nuclear kB sunt de asemenea activați, iar expresiile citokinelor proinflamatoare precum interleukina 1 cy, IL-6 și TNF-α sunt stimulate. Modificările în cinetica activării receptorului sau activitatea integrinelor pot fi responsabile de comportamentul observat. Alternativ, particulele înglobate prin fagocitoză stimulează producerea de ROS. Reglarea redox a expresiei genelor este un  fenomen general pentru numeroase celule.

Pentru a testa activitatea biologică a zeoliților și a altor silicați aceștia au fost măcinați mecanic la particule de mici dimensiuni (MZ) la care a fost testată toxicitatea și activitatea anticanceroasă in vivo, dovedind lipsa toxicității clinoptinolitului administrat oral și utilitatea sa în tratamentul cancerului pe modele cu animale. Experimente in vitro cu diferite linii celulare au arătat că MZ modifică căile de semnalare intracelulară, determinând inhibiția semnalelor de supraviețuire și inducerea genelor supresorilor tumorali.

Materiale și metode

Clinoptinolitul natural

Pulberea fină de clinoptinolit natural a fost obținută prin micronizare tribomecanică.

NOTA: asa zisa „activare” este o macinare foarte fina, nimic mai mult…

Compoziția MZ a fost deteminată prin spectroscopie de absorbție atomică. Analizele de fază ale MZ au fost efectuate prin difractometria pulberii folosind un difractometru Siemens 5000D cu radiație CuKα în regiunea 2θ 4-80^o. Analiza termogravimetrică și diferențial termogravimetrică a MZ a fost efectuată folosind un aparat  Mettler-Toledo  cu rata de încălzire de 10⁰K/min în atmosferă de azot. Curbele de distribuție a dimensiunii particulelor au fost efectuate cu un analizor al dimensiunii particulelor prin dispersia luminii laser Malvern.

Linii de celule și teste de proliferare

Efectele MZ asupra proliferării celulare in vitro au fost studiate pe mai multe linii de celule umane; fibroblaste diploide (Hef522), carcinom cervical (HeLa), carcinoame de colon (CaCo-2, HT-29, SW 620), carcinoame mamare (MCF-7, SkBr-3) și o linie de fibrosarcom de șoarece. Celulele au fost menținute prin cultivare în mediu Eagle modificat Dulbecco, suplementat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 2mM L-glutamină, 100 U/mL penicilină și 100µg/mL streptomicină, în atmosferă umidificată cu 5% CO₂ la 37^oC. În experimentele de testare a proliferării, celulele au fost întinse în plăci în concentrația de 1 x 10⁴ celule/mL în microplăci-96 (200µL/bazin). După incubare peste noapte, mediul standard a fost înlocuit cu mediu pretratat cu 0,5, 5 sau 50mg/mL MZ. Mediul și MZ au fost amestecate și după 18 ore de scuturare, MZ a fost peletat prin centrifugare (5000g timp de 10 min).

Celulele au fost apoi incubate timp de încă 72 de ore, după care a fost determinată viabilitatea celulelor prin testul MTT care detectează activitatea dehidrogenazei în celulele viabile. În  acest scop a fost descărcat mediul și s-a adăugat MTT în fiecare bazin în concentrații de 20µg/40µL. După 4 ore de incubare la 37^oC precipitatele au fost dizolvate în 160µL DMSO. Absorbanța a fost măsurată cu un cititor de testare cu imunosorbant legat enzimatic la 570nm. Proliferarea celulară a fost exprimată ca % absorbanță înregistrată pentru linia de celule tratată cu o anumită concentrație de MZ față de absorbanța martorului, celule netratate, și exprimată în %.

Analiza p21^WAF/CIP1 și p27^KIP1

Experimente cu p21^WAF1/CIP1 și p27^KIP1 au fost efectuate pe celule de adenocarcinom uman CaCo-2c și carcinom cervical uman HeLa. Celulele, crescute inițial în vase pentru culturi de celule, au fost colectate și inoculate în plăci de sticlă. După 24 ore mediul a fost înlocuit fie cu mediu standard proaspăt (celule martor), fie cu mediu pretratat cu 50mg/mL MZ. După 72 de ore de incubare celulele au fost spălate cu PBS și fixate în metanol cu 3% peroxid de hidrogen.

Au fost analizate imunocitochimic proteinele, p21^WAF/CIP1 și p27^KIP1. Legarea nonspecifică a fost  blocată prin  aplicare de ser normal de iepuri (1:10) timp de 30 min. Anticorpii primari p21 (5µg/mL, PharMingen) și p27 (2µg/mL, Transduction Laboratories) au fost lăsați să se lege peste noapte, la 4⁰C. Plăcile au fost spălate de 3 ori cu PBS. Anticorpii secundari (iepure antișoareci; Dako – Danemarca) au fost aplicați timp de o oră la temperatura camerei. În final, conjugatul peroxidază-antiperoxidază (Dako) diluat la 1:100 în PBS, a fost aplicat timp de o oră la temperatura camerei. După spălare cu PBS plăcile au fost colorate cu tetraclorură de diaminobenzidină 0,025% (Sigma) conținând 4% H₂O₂ timp de 7 min și contracolorate cu hematoxilină timp de 30 sec. Plăcile au fost analizate cu un microscop optic (Olympus). Concentrația de colorare nonspecifică de fundal a fost stabilită pentru fiecare determinare folosind celule martor procesate în același mod, dar fără expunere la anticorpii primari.

Concentrația de antigen a fost stabilită prin estimarea intensității vizuale relative a unui marcaj cromogenic, rezultatele fiind exprimate pe o scară cu 3 puncte; colorare negativă, + colorare slabă, și ++, colorare moderată.

Studii biochimice ale căilor de semnalare

Au fost folosite următoarele; factor de dezvoltare epidermală (EGF; Intergen), factor de dezvoltare derivat din plachete (PDGF) BB (Amgen), scară de markeri pentru proteine (10-200kDa; Life Technologies), leupeptină și un minikit de inhibitor de proteaze (Boehringer-Mannheim), Pefabloc (Fluka), aprotinină (Trasylol, Bayer) și membrane de nitroceluloză (Millipore). Anticorpii Anti-Akt, anti-pAkt, anti-JNK, anti-pJNK și anti-pERK2 (MAPK) policlonal de iepuri purificați prin afinitate au fost achiziționați de la New England Biolabs. Anticorpii policlonali de iepuri anti-ERK 2 (C-14) au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotechnology. Anticorpi secundari, conjugați cu peroxid de imunoglobulină anti-șoareci de la Amersham/Pharmacia și proteina A conjugată cu peroxid de la Kirkegaard and Perry Laboratories.

Celulele de fibrosarcom murinic au fost dezvoltate în plăci Petri (diametru 6cm) în mediu RPMI cu 10% FBS până la 80% confluență. Înainte de a începe experimentele, celulele au fost menținute în starvație timp de 24 de ore. Apoi celulele au fost tratate cu mediu pretratat cu MZ cu sau fără 10% FBS, timp de 0, 5, 30 și 6 min, sau cu EGF (100µg/mL) și PDGF (40µg/mL). După tratament, celulele au fost spălate cu PBS și raclate în tampon de liză rece ca gheața, conținând 50mM acid etansulfonic hidroxietilpiperazină, pH 7,2, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 20 mM NaF, 2mM ortovanadat de Na, 1% Triton X-100, 10% glicerol și inhibitori de proteaze (1mM Pefabloc, 10µg/mL leupeptină și 1% Trasylol). După 45 min la 4^oCcu agitare ușoară, a fost preparată o fracție solubilă prin centrifugare la 4^oC timp de 15min la 13 000g.  Cantități egale de lizate de celule (măsurate prin testul Bradford) au fost amestecate cu 3 x tampon de sulfat de dodecil sodic (SDS) și încălzite 2 min la 98^o C. Proteinele au fost separate prin electroforeză în gel de SDS poliacrilamidă și transferate în membrane de nitroceluloză. Imunobloturile au fost blocate cu 5% albumină din ser bovin în TBS timp de o oră, incubate o oră cu anticorpii primari (anti-Pakt, anti-pJNK, anti-pERK2) în TBS, spălate de 6 ori timp de 10 min fiecare în TBS, spălate de 6 ori timp de 10 min. După spălări, imunobloturile au fost vizualizate folosind chemiluminiscență stimulată SDS, 100mM 2-mercaptoetanol la 58^o C timp de 25 min, spălate extensiv cu TBS, reblocate ca mai sus și reblotate cu anticorpii potriviți.

Izolarea fragmentelor apoptotice de ADN

Celulele HeLa (1 x 10⁵) au fost crescute în vase de câte 10mL timp de 24 de ore, după care mediul a fost descărcat și înlocuit cu mediu pretratat cu MZ. După 24 de ore celulele au fost tripsinizate, peletate prin centrifugare la 1200g și spălate de 2 ori în PBS. Apoi au fost resuspendate 10 sec în 100µL tampon de liză (1% NP-40 în 20mM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH 7,5) și centrifugate 5 min la 3000g. Supernatantul a fost transferat într-un nou tub Eppendorf, iar peletele au fost incubate încă odată cu 100µL tampon de liză și centrifugate ca înainte. Supernatantele au fost reunite și incubate 2 ore în 1% SDS și RNază (5µg/µL) la 56^oC, după care a fost adăugată proteinaza K la concentrația locală de 2,5 µg/µL peste noapte. Fragmentele de ADN au fost peletate prin adăugarea de1/2 volum de acetat de amoniu 10mM și 2,5 volume de etanol absolut prerăcit. După centrifugare (30min, 12 000g) peletele au fost spălate cu etanol 70%, centrifugate 10 min la 12 000g, uscate și dizolvate în 20µL tampon TE (10mM Tris-HCl, pH 7,4, 1mM EDTA pH 8). ADN-ul a fost vizualizat în gel de 1,5% agaroză.

Animale

Șoareci

Au fost folosiți șoareci CB A/HZgr și C57BL/6 de ambele sexe. Studiile de toxicitate au fost efectuate pe CBA/HZ, iar experimentele cu tumori pe ambele sușe. Pentru testarea toleranței nonclinice au fost folosiți șoareci masculi din sușa BALB/c. Până la începerea experimentelor animalele aveau vârsta de aprox. 4 luni și cântăreau 25-28g, fiind menținute în condiții standard, cu acces nerestricționat la hrană și apă.

Șobolani

Pentru studiile de toxicitate și toleranță nonclinică au fost folosiți șobolani Wistar de ambele sexe proveniți de la Institute for Medical Research, Zagreb, Croația. La începutul experimentelor aveau vârsta de 2-3 luni și greutatea medie de 300g (masculii) și 200g (femelele).

Câini

În experimente au fost folosiți 22 câini, de diferite rase, cântărind 3-42kg, de ambele sexe, cu vîrste de 5-14 ani. Datele celor 14 câini la care s-a observat îmbunătățirea stării sunt date în Tabelul 2.

Studii de toxicologie

Toxicologia preclinică a fost determinată conform standardelor și reglementărilor Organization for Economic Cooperation and Development în practica de laborator (Paris 1998). Testarea a fost abordată prin stabilirea testului ”limită” – aplicarea dozelor mari de MZ, 2 x 200 și 2 x 500 mg/șoarece pe zi oral (gavaj) timp de 6, 14 și 30 de zile. Întrucât MZ nu a produs moartea șoarecilor într-un test ”limită” a fost efectuat un test ”up and down” pe șoareci, cu doze zilnice de 60-400mg/animal (MZ administrat oral, ca gavaj, timp de 30 de zile). Nu a fost observată toxicitate. A fost deci efectuat un test clasic de toxicitate acută, subcronică și cronică pe șoareci și șobolani de ambele sexe (separat).

Șoareci

Șoarecii au aparținut sușei CBA/HZgr. MZ a fost administrat în hrană (MZ pulbere amestecată cu hrana standard în raportul 5:75). Durata studiului a fost după cum urmează: toxicitate acută – o lună; toxicitate subcronică – până la 3 luni; toxicitate cronică – până la 6 luni. Au fost urmărite modificările fenotipice, modificările de comportament și supraviețuirea (zilnic), modificările de greutate corporală (săptămânal), cantitatea de hrană și apă consumate (în zilele 14 și 28 când șoarecii erau ținuți 24 de ore în cuști metabolice, 5 animale într-o cușcă), modificările parametrilor hematologici și de chimie clinică a serului (eritrocite, leucocite, plachete, hematocrit, hemoglobină, glucoză, fosfatază alcalină, aspartat aminotransferază, alanină aminotransferază, bilirubină, fosfor anorganic și calciu; după 1, 3 și 6 luni); parametrii clinici ai chimiei urinei (glucoză, proteine, urobilinogen, bilirubină, nitriți, eritrocite, leucocite, pH, greutate specifică; urina a fost colectată atunci când animalele erau ținute, o dată pe lună, timp de 24 de ore, în cuști metabolice). Analiza patohistologică a ficatului, splinei, rinichilor, creierului, plămânilor, testiculelor, ovarelor, duodenului, ochilor, stomacului, intestinelor gros și subțire, mușchilor, miocardului, pancreasului, timusului și nodului limfatic axilar au fost efectuate  pe animale experimentale sau martor, ucise.

Șobolani

Au fost folosiți șobolani Wistar. MZ a fost administrat în hrană (amestecat cu furaj standard în rapoartele 25:75 și 45:50). Durata studiului a fost după cum urmează: toxicitate acută, o lună; toxicitate subcronică, 3 luni; toxicitate cronică , 12 luni. Au fost urmărite modificările fenotipice, modificările de comportament și supraviețuire (zilnic), modificările de greutate corporală (la fiecare 4 zile), cantitatea de furaje (zilnic) și apă consumată (la fiecare 4 zile), modificările parametrilor hematologici și chimici ai serului (o dată pe lună). Analiza patohistologică a ficatului, splinei, plămânilor, rinichilor, testiculelor, ovarelor și creierului a fost efectuată pe animale experimentale și martor ucise, după 1, 6, și 12 luni.

Toxicitatea reproductivă/în dezvoltare a fost testată pe șoareci (CBA/HZgr) datorită perioadei scurte de gestație și cantității mari de resturi. MZ a fost administrat în furaj (pulbere de MZ amestecată cu furaj standard în raport de 25/75%). Pentru studiile de toxicitate reproductivă 10 masculi și 10 femele au fost hrăniți cu furaje amestecate cu MZ timp de 14 și 50 de zile înainte de împerechere. Tratamentul a continuat în perioada de sarcină (un ciclu) și în timpul presarcinii și sarcinii până la apariția progeniturilor. Aceeași pereche de animale a fost hrănită cu MZ și urmărită timp de 4 cicluri consecutive (aprox. 4-5 luni). Aceeași rețetă a fost folosită pentru animalele martor, netratate. Generația parentală a fost urmărită pe durata ciclului, fertilitate (prezența sau absența de resturi în ciclul respectiv), incidența nașterilor, mortalitate și aspectul patohistologic al ovarelor după al 4-lea ciclu. Numărul de progenituri total și viabile și de progenituri viabile născute, sporul în greutate corporală al progeniturilor și mortalitatea acestora până la înțărcare au fost de asemenea urmărite.

Pentru teratologie, șoareci sănătoși, netratați, cu sarcină, au fost furajați cu MZ amestecat  în furajul convențional din ziua a 6-a până  în  ziua a 16-a de gestație, iar șoarecii au fost omorâți cu o zi înainte de parturiție. Fetușii au fost analizați microscopic ca patologie.

Toleranța locală a fost evaluată pentru a stabili dacă substanța testată este tolerată în zonele corpului care au intrat în contact cu ea în timpul administrării.

Testarea toleranței dermale la doze repetate a fost efectuată pe șobolani Wistar masculi și pe șoareci BALB/c masculi. MZ a fost aplicat pe pielea rasă din regiunea dorsală a animalelor în 3 moduri: (a) ca pulbere originală; (b) amestecat cu o cremă neutră în raportul 1:1: (c) amestecat cu ulei de parafină în raportul de 1:1. Animalele au fost tratate de două ori pe zi timp de 28 de zile. Zilnic au fost examinate modificările macroscopice ale pielii tratate, iar regiunea dorsală stângă a fost folosită ca martor. Pentru analiza microscopică a modificărilor au fost prelevate probe la o zi după ultimul tratament.

Rezultate

Proprietățile clinoptinolitului natural tratat mecanic

Clinoptinolitul natural tratat mecanic (MZ) conține aprox. 85% clinoptinolit. Restul de 15% constă din silice, montmorillonit și mordenită. Compoziția sa chimică este dată în Tabelul 1. Analiza termică diferențială a MZ arată că rata maximă a desorbției apei se produce la 50^oC, indicând că modificarea greutății mostrei la 50^oC corespunde cu eliminarea umidității slab legate din microstructura solidului. Analiza desorbției apei arată că MZ conține aprox. 16% apă (apă slab legată + apă zeolitică) din care aprox. 2% este apă slab legată (Fig. 1 A, B). Nu s-au observat schimbări de fază la încălzirea zeolitului la 800^oC. Analiza mărimii particulelor de MZ arată că frecvența maximă a particulelor (aprox. 13%) apare la 1,5µm, cu dimensiunea medie de 2,09µm la 25% din particule cu 1,5µm, 25% cu până la 1,5µm, 50% până la 2µm și 75% până la 3µm (Fig. 1 C și D).

Tabelul 1. Compoziția chimică a MZ

Fig. 1 A. Curba termogravimetrică a MZ ; dm/dt modificarea diferențială (dm) a masei probei în intervalul de timp dt; T temperatura de încălzire. B. Pierderea de greutate la încălzirea controlată a  MZ față de temperatura ambiantă (T= 25^oC) până la T=800^oC. C. Distribuția dimensiunii diferențiale a particulelor prin  numărul de MZ. N_D – procent de particule cu diametrul D. ƩN_D  – % din particule cu diametrul D. D – Distribuția cumulativă a dimensiunii paticulelor prin numărul de MZ. ƩN_D – % din particule cu diametre între D=0 și D.

Efectul MZ asupra proliferării liniilor de celule dezvoltate in vitro

Fig. 2 prezintă proliferarea celulelor Hef522, HeLa, CaCo-2, SW620, HT-29, MCF-7, SKBR-3 și celulelor de fibrosarcom de șoarece după 3 zile de tratament. Dezvoltarea tuturor liniilor de celule, cu excepția Hef522 și SW620, a fost inhibată semnificativ la doza de 50mg/mL. Cea mai puternică inhibiție (50%) a fost înregistrată pentru celulele de fibrosarcom, dezvoltarea SW620 a rămas nemodificată, iar cea a celulelor Hef522 a fost ușor stimulată. Rezultate similare s-au obținut în testul de incorporare a ⁅³H⁆timidinei în prezență de 10% FBS în celulele de fibrosarcom de șoarece.

Fig. 3. Efectul mediului pretratat cu 0,5, 5,0 și 50,0mg/mL MZ asupra creșterii diferitelor linii celulare

Barele verticale – deviații standard; săgețile – diferențe statistice în comparație cu martorul

Analiza căilor de semnalare intracelulară în celulele tratate cu MZ

Studii anterioare au arătat că expunerea celulelor la particule de silicat determină activarea MAPK, protein kinazei C și a protein kinazelor JNK activate de stres. Rezultate semnificative au fost obținute determinând Akt. Akt, sau protein kinaza B, mediază semnalele de supraviețuire în aval de fosfoinozitid-3 kinaza prin fosforilarea proteinelor Bad. Am observat o creștere a fosforilării Akt ca răspuns la ser, EGF, sau tratament cu insulină. Adăugarea de MZ mediului  pretratat care conține 10% FBS în celule scade fosforilarea Akt, în comparație cu celulele tratate numai cu ser, iar adăugarea factorilor de creștere EGF și PDGF îi reface activitatea (Fig 3A) și depășește efectele MZ asupra creșterii celulelor. Determinarea activității Akt la diferiți timpi după adăugarea MZ mediului pretratat cu 10% FBS micșorează ușor concentrația de pAkt după 5 min. Scăderea este mai pronunțată după 30 și 60 min de tratament (Fig. 3B). Adăugarea MZ în mediul pretratat fără ser la celule mărește activitatea Akt în comparație cu celulele lipsite de ser. Tratamentul peste noapte al celulelor cu EGF mărește activitatea Akt. Tratamentul combinat peste noapte al celulelor cu EGF și pretratamentul cu MZ micșorează activitatea Akt, indicând că inhibiția Akt poate fi legată de inhibiția MZ a căilor declanșate de EGF.

Activitatea proteinei Akt după 5 min de la adăugarea mediului pretratat cu MZ la celulele de fibrosarcom murinic. B. Micșorarea activității proteinei Akt la diferiți timpi după tratamentul celulelor de fibrosarcom murinic cu mediu pretratat cu MZ. C. Efectul mediului lipsit de mediu pretratat cu MZ asupra activității MAPK în celulele de fibrosarcom murinic. W/B: western blot; FBS: ser fetal bovin; MZ: clinoptinolit activat mecanic; pAkt: Akt fosforilat; EGF: factor de dezvoltare epidermală; PDGF: factor de creștere derivat din plachete; MAPK: protein kinază activată de mitogen; pMAPK: protein kinază activată de mitogen fosforilată

Activitatea MAP kinazei a crescut în celulele lipsite de ser ca răspuns la EGF, PDGF sau ser. Adăugarea de mediu pretratat numai cu MZ în celulele lipsite de ser mărește numai activitatea MAPK după 5min până la 30min. Activitatea MAPK revine la nivelul normal (Fig. 3 C). Adăugarea de mediu pretratat cu MZ plus 100% ser scade puțin activitatea MAPK în comparație cu celulele tratate numai cu ser sau cu celulele incubate numai cu mediu pretratat cu MZ. Aceste rezultate concordă cu cele din testul cu timidină.

Mediul pretratat cu MZ adăugat la celule singur sau în combinație cu ser nu produce modificări ale activității JNK.

Efectul MZ asupra expresiei inhibitorilor kinazelor dependente de ciclină, p21^WAF1/CIP1 și p27^KIP1 a fost testat imunocitochimic în  celule HeLa și CaCo-2. Tratamentul cu MZ induce expresia p21^WAF1/CIP1 în celulele CaCo-2 și p27^KIP1 în celulele HeLa, în timp ce celulele netratate au fost negative pentru expresia p21^WAF1/CIP1/p27^KIP1 (Fig. 4).

Fig. 4. Analiza imunohistochimică a p27^KIP1 asupra celulelor martor HeLa (A) și  celulelor HeLa după incubare cu mediu pretratat cu MZ (B). În culoare brună celulele care expresează p27^KIP1

Inducerea morții programate a celulelor – apoptozei

Pentru a evalua dacă inhibiția dezvoltării celulare de către MZ se datorează apoptozei s-a încercat izolarea de mici fragmente de ADN. Cantitatea mare de fragmente mici (degradate) de ADN în  izolatul de ADN ar indica că MZ induce apoptoza în celulele tratate. Rezultatul izolării fragmentelor mici de ADN din celulele HeLa este arătat în Fig. 5. ADN-ul izolat din celulele tratate cu MZ prezintă o degradare semnificativă în comparație cu ADN-ul din celule netratate. Degradarea ADN-ului în celulele tratate cu MZ este determinată de inducerea apoptozei.

Fig. 5. Fragmente apoptotice de ADN în 1,5% gel de agaroză. 1. Marker al greutății moleculare IX a ADN; 2. ADN izolat din celule HeLa netratate; 3. ADN izolat din celule HeLa tratate cu MZ. Săgeată; Fragmente de ADN degradat, cu greutate moleculară mică.

Toxicologie

Administrarea orală (în hrană) de MZ la șoareci și șobolani timp de 6 și 12 luni nu a produs modificări care ar putea fi considerate un efect toxic al tratamentului. MZ  a egalizat (reglat) și scurtat perioada de presarcină. Numărul de pui per naștere a crescut la șoarecii tratați cu MZ; probabil din acest motiv câștigul în  greutate corporală până la înțărcare s-a micșorat. În consecință s-a observat o mortalitate mai mare a puilor între zilele 8 și 21 ale perioadei neonatale. Totuși nu au apărut diferențe între animalele martor și cele tratate care ar sugera toxicitate reproductivă atribuită administrării de MZ. MZ nu elicită toxicitate în perioada de organogeneză. Substanța testată, MZ, nu a fost toxică sau alergenă pentru piele.

Efectul MZ asupra dezvoltării tumorale în modele pe animale

Studiile efectuate pe culturi de celule au sugerat că MZ inhibă in vitro  dezvoltarea celulelor de cancer. Au fost efectuate studii in vivo pe șoareci, șobolani și câini pentru a studia efectele MZ asupra tumorilor transplantabile murinice, melanomului B16 și carcinoamelor mamare. Celule de carcinom mamar aplastic au fost injectate în șoldul drept la 2 grupe de șoareci. Un grup (n = 14) a fost hrănit cu suplement cu MZ începând cu 15 zile înainte de transplantarea tumorii și până la moartea animalelor. Celălat grup (n = 14) a fost hrănit cu MZ din ziua transplantării tumorii până la moartea animalelor. Un grup de 5 șoareci cu tumori care au primit hrana standard a fost folosit ca martor. Dezvoltarea tumorală a fost semnificativ inhibată pentru ambele grupe de animale hrănite cu suplement de MZ (Fig. 6). Curbele dezvoltării tumorale pentru animalele individuale au fost uniforme, în special atunci când MZ a fost administrat înainte de transplantarea tumorilor. Nu au existat diferențe de supraviețuire între cele 2 grupuri.

Fig. 6. Dezvoltarea tumorilor după injectarea a 1 x 10⁶ celule de carcinom aplastic mamar în șoldul drept al șoarecilor CBA/HZgr. Animalele au fost expuse la 20% MZ în hrană, fie din ziua transplantării tumorale (n = 14), sau cu 15 zile înainte de transplantarea tumorală (n = 14). Șoarecii martor au primit hrană standard. Bare verticale: Deviația standard. Diferențele dintre martori și ambele grupuri experimentale au fost semnificative statistic (p < 0,001 test Student) în zilele 25, 30 și 35.

Celulele de melanom B16 au fost inoculate subcutanat șoarecilor C57BL în ziua 0. Pentru următoarele 30 de zile șoarecilor li s-a administrat oral MZ de 5 ori pe zi. A fost măsurat volumul tumorii; a fost mai mic la 5 din 80 de șoareci (doză zilnică 150mg/șoarece) decât la grupul martor. (Fig. 7 A). În pofida faptului că tumorile au început să crească mai repede după abrogarea terapiei cu MZ (zilele 30-60 după transplantarea tumorii) șoarecii au trăit mai mult timp după tratare cu 200 și 150 mg MZ față de animalele martor. (Fig. 7B). Șoarecii folosiți pentru formarea metastazelor experimentale de carcinom pulmonar aplastic mamar au fost hrăniți cu MZ cu 15 zile înainte de injectarea celulelor tumorale până la sfârșitul experimentului (18 zile după transplantarea tumorii). Martorii au consumat hrană standard. Fiecare din cele 2 grupe a cuprins 20 de animale. După ce au fost înregistrați 20-40 noduli/animal nu au existat diferențe între grupuri.

Fig. 7. Rata de creștere (A) a melanoamelor B16 cu 150mg MZ/șoarece per zi și supraviețuirea (B) a șoarecilor cu melanoame tratați cu 3 doze diferite de MZ

Tratamentul cu MZ nu a avut efect asupra dezvoltării in vivo a două carcinoame mamare care au diferit de cele arătate în Fig. 6 (date neprezentate).

Din 22 câini suferind de diferite tumori spontane și tratați cu MZ, 14 au răspuns la terapie, tumora dispărând complet sau micșorându-se. (Tabelul 2). Dintre 3 câini cu tumori de prostată, arătate sonografic, unul avea și un chist al prostatei. (cazul 3). Câinele era liniștit, lipsit de poftă de mâncare, și se mișca cu greutate. Când terapia obișnuită nu a dat rezultate, a început terapia cu MZ. După numai 2 zile de tratament câinele a redevenit activ, în ziua a 3-a a început să mănânce normal, iar din ziua a 4-a să urineze normal, urină fără sânge. În ziua a 10-a dimensiunile chistului și tumorii s-au micșorat, iar după o lună au dispărut complet. Deși prostata era ceva mai mică, câinele nu prezenta semne de boală. Valorile foarte mari din preterapie ale aspartat aminotransferazei serului  (497µmol/L) și ale alanină aminotransferazei (433µmol/L) au scăzut după o lună de terapie cu MZ la nivele normale (16 și 43µmol/L) și au rămas în domeniul normal pentru întreaga perioadă de observație (5 luni).

Tabelul 3. Efectul tratamentului cu MZ asupra creșterii tumorilor spontane la câini (→ valori înainte și după tratamentul cu M Z, a z după începerea tratamentului, HMT: hematocrit, ALT; alanină).

Fig. 6. Creșterea tumorii după injectare de 1 x 10⁶ celule de carcinom aplastic mamar în șoldul drept al șoarecilor CBA/HZgr. Animalele au fost expuse la 20% MZ în hrană fie din ziua transplantării tumorii (n = 14), fie cu 15 zile înainte de transplantare (n = 14). Șoarecii martor au primit hrană standard. Bare verticale: Deviație standard. Diferențele dintre martori și ambele grupe experimentale au fost semnificative statistic (p < 0,001 în testul Student) pentru zilele 25, 30 și 35.

Celulele B16 de melanom au fost inoculate subcutanat șoarecilor C57BL în ziua 0. În următoarele 30 de zile șoarecilor li s-a dat MZ oral de 5 ori pe zi. A fost măsurat volumul tumorii; era mai scăzut la 5 din 80 șoareci (doza zilnică 150mg/animal)  față de grupul martor (Fig. 7A). În pofida faptului că tumorile au început să crească mai repede după abrogarea terapiei cu MZ (zilele 30 și 60 după transplantarea tumorilor) șoarecii au trăit semnificativ mai mult după tratarea cu 200 și 150mg MZ față de animalele martor (Fig. 7B). Șoarecii folosiți pentru formarea de metastaze pulmonare au fost hrăniți cu MZ cu 15 zile înainte de injectarea celulelor tumorale, deci cu 18 zile după transplantarea tumorii. Martorii au consumat hrană standard. Fiecare din cele 2 grupe cuprindeau câte 20 animale. Au fost găsiți aprox. 20 – 40 noduli per animal, fără diferențe între grupe.

Fig. 7. Rata de creștere (A) a melanoamelor B16 tratate cu 150mg  MZ/șoarece pe zi și supraviețuirea (B) a șoarecilor cu melanoame tratați cu 3 doze diferite de MZ

Tratamentul cu MZ nu a avut efect asupra dezvoltării in vitro a două carcinoame mamare care difereau de cele din Fig. 6 (datele nu sunt prezentate).

Din 22 câini cu diferite tumori spontane care au fost tratați cu MZ, 14 au răspuns la terapie, tumora dispărând complet sau micșorându-și dimensiunile (Tabelul 2). Dintre cei 3 câini cu tumori de prostată unul a prezentat sonografic și un chist al prostatei (cazul 3). Câinele era liniștit, lipsit de poftă de mâncare și se mișca cu greutate. Când terapia obișnuită nu a avut efect, s-a început terapia cu MZ. După numai 2 zile de tratament câinele a redevenit activ; în ziua a 3-a a început să mănânce normal, iar dintr-a 4-a zi să urineze normal, fără sânge în urină. În ziua a 10-a dimensiunile chistului și tumorii s-au micșorat, iar după o lună au dispărut complet. Deși prostata s-a micșorat, valorile aspartat  transaminazei (497µmoli/L) și alanină aminotransferazei (433µmoli/L) din ser înainte de terapie, au scăzut după o lună de terapie cu MZ la niveluri normale (16 și 43µmoli/L) și au rămas la nivele normale pe întreaga perioadă de  observație (5 luni).

Tabelul 2. Efectul tratamentului cu MZ asupra creșterii tumorilor spontane ale câinilor (→ valori înainte și după tratamentul cu MZ, a t, după începerea  tratamentului, HMT: hematocrit, ALT: alanină aminotransferază, AST: aspartat aminotransferază, CGT;γ-glutamil transferază, L: număr de leucocite)

^a La începutul terapiei

^b Dependent de hormoni

Un alt câine (cazul 2) avea, în plus față de tumora la prostată, tumori la testicule. Testiculele aveau aprox. 20cm diametru când a început terapia cu MZ. După o lună de terapie testiculele s-au micșorat cu 1/3. După 2 luni de terapie testiculele s-au micșorat la ½, iar după 3 luni la 1/3 din dimensiunea dinainte de tratament. (Fig 8 A). Totuși prostata a rămas mărită.

Fig. 8. Rata de creștere a tumorilor testiculelor (A) și hiperplazia glandei salivare (B) la câini. A: pudel, 12 ani, cazul 2.B. Pinch, 5 ani, caz 13. Săgeată: ziua de încetare a terapiei; Alte detalii în Tabelul 1

Al 3-lea câine (caz 1) diagnosticat cu adenocarcinom de prostată a ajuns la clinică în stare foarte proastă. Urina cu mare greutate. După o lună de terapie clasică nu au fost observate îmbunătățiri. În uretra câinelui a fost pus un cateter. Terapia a continuat încă 2 săptămâni, dar fără efect. Câinele era ante finem iar proprietarii au solicitat eutanasierea. Atunci, terapia clasică a fost înlocuită cu terapia cu MZ (3 x 200mg/zi). După o săptămână s-a observat o îmbunătățire generală și a fost îndepărtat cateterul. După 14 zile de terapie nu mai erau vizibile semne ale bolii. Terapia a continuat încă 14 zile cu îmbunătățiri zilnice ale sănătății. Proprietarii au decis castrarea, care elimină problemele legate de prostată și a fost oprită terapia cu MZ. După alte 8 luni câinele era încă în viață și nu avea probleme de sănătate.

Trei câini sufereau de tumori ale pielii. Unul dintre ei avea 3 noduli pe piele deasupra cozii. Două au fost îndepărtate iar a treia, cel mai mic, a fost lăsat. Histologic, tumora a fost diagnosticată drept carcinom planocelular. După o lună de terapie cu MZ tumora de mărimea unei cireșe și-a micșorat dimensiunea cu 1/3. După alte 5 săptămâni leziunea a dispărut complet. După 7 luni câinele este încă sub terapie. Câinele care a împlinit 11 ani este vioi și în stare foarte bună.

Un alt câine (cazul 10) suferea de adenocarcinom al pielii cozii care a fost îndepărtat chirurgical. Totuși, la 2 săptămâni de la intervenție, rana nu se vindecase și se lua în considerație amputarea. Câinelui i s-a administrat MZ oral în capsule și pe rană a fost împrăștiată pulbere de MZ. Rana s-a vindecat într-o săptămână.

Al treilea câine (cazul 12) avea o excrescență pe limbă cu diametrul de aprox. 2 cm. Histologic era un carcinom planocelular. După îndepărtarea chirurgicală a tumorii rana nu se vindeca. Câinelui i s-a administrat oral MZ în capsule și local s-a împrăștiat pulbere de MZ. După 5 zile biopsia rănii nu mai era vizibilă.

Un câine în vârstă de 5 ani (cazul 13) a fost diagnosticat cu un nodul de mărimea unei nuci pe glanda salivară stângă și a fost tratat cu terapia convențională timp de 4 luni fără succes. În acest timp glanda s-a mărit, iar câinele avea probleme grave la înghițit și salivație. După o săptămână de terapie cu MZ nodulul a devenit mai moale și mai mic cu 1/3. După o altă săptămână nodulul a dispărut complet și era palpabilă numai capsula.

Au fost diagnosticate adenocarcinoame mamare, sub formă de noduli multipli (cu dimensiuni între fasolea verde și nucile mari) la 6 câini femele. După începerea terapiei cu MZ nodulii au dispărut complet; la un câine după 10 zile, fără semne de boală după 12 luni; la 4 câini după 2-3 luni (nodulii mai mici) și 4-6 luni (nodulii mai mari) fără semne ulterioare de boală, acum 2 luni; iar la un câine nodulii s-au micșorat cu 50% după 58 zile de tratament.

Într-un caz, un câine (cazul 14) cu cancer pulmonar, după 14 zile de tratament cu MZ (4 x 400mg/zi) semnele tumorilor au dispărut complet.

În plus față de efectele MZ din boala primară, toți câinii, chiar cei la care boala primară nu se vindecase, au răspuns la terapia cu MZ în 7 zile, cu îmbunătățiri general constituționale și comportamentale, care se păstrau chiar și după întreruperea terapiei. La fel s-a observat pentru unii parametri hematologici și clinici ai serului măsurați înainte și după terapie. Hematocritul a scăzut la normal în  cazul 1. Valorile mari ale bilirubinei totale din ser au revenit la normal în cazurile 3 și 14, iar modificarea concentrației de uree din ser a fost notată în cazurile 11 și 13. Îmbunătățirea cea mai pronunțată a fost notată pentru aspartat aminotransferază și fosfatază alcalină leucocitară, cu valori în preterapie normalizate imediat după începerea terapiei (numerele 1, 2, 3, 10, 13 și 14 din Tabelul 2).

Discuții

Numeroși compuși naturali au fost folosiți în tratamentul unor boli, inclusiv ceaiul verde și extractele din soia. Produse dietetice și compuși antioxidanți au efecte benefice în special la pacienții cu cancere, dar mecanismul nu este complet cunoscut. Noi am studiat efectul particulelor de clinoptinolit natural asupra dezvoltării unor modele de cancer in vitro și in vivo. Am găsit că zeolitul clinoptinolit activat mecanic acționează ca agent terapeutic în studii in vivo pe animale și în culturi model de celule.Clinoptinolitul aplicat oral  la șoareci și câini suferind de diferite tipuri de tumori determină micșorări ale unor tumori și îmbunătățirea stării generale de sănătate la unele animale.

Domeniul de efecte este divers de la răspunsuri negative ale tumorilor, normalizarea parametrilor biochimici, prelungirea duratei de viață și micșorarea dimensiunilor tumorilor. Cele mai bune rezultate au fost înregistrate în tratamentul cancerelor de piele la câini, sugerând că adsorbția unor componente active determină activitatea MZ (acțiune prin contact direct). Studiile efectuate pe culturi de celule au indicat că tratamentul cu MZ afectează proliferarea și supraviețuirea unor linii de celule de cancer. Adăugarea de MZ inhibă proliferarea celulelor în mod dependent de concentrație, în parte prin inducerea inhibitorilor kinazelor dependente de cicline, inhibiția expresiei B/Akt și inducerii apoptozei.

Experimentele descrise au fost efectuate cu zeolitul nontoxic, natural, cu conținut mare de silice, clinoptinolit. Particulele de zeolit au fost încărcate negativ pe întregul domeniu de pH studiat (pH 1-11). Microscopia electronică a arătat lipsa fibrelor, cele mai multe particule fiind rotunde, cu suprafețe rugoase. Lipsa particulelor fibroase, încărcate pozitiv, a fost încurajatoare, întrucât acest tip de particule sunt prezente în azbest și erionit, care sunt carcinogenice și mutagenice. În plus, particulele activate de zeolit nu catalizează producerea de radicali hidroxil, spre deosebire de azbest sau erionit. Absența particulelor fibroase capabile să producă radicali hidroxil face zeoliții nontoxici și noncarcinogenici, cel puțin la aplicare orală.

Silicații și aluminosilicații particulați pot interacționa direct cu anumite celule și modifica căile lor intracelulare, conducând la reglarea expresiei genelor. MZ este eficient la inhibiția protein kinazei B/Akt în experimentele in vivo cu celule canceroase. Astfel de inactivări determină inhibiția creșterii și mărirea apoptozei celulelor de cancer. Inhibiția Akt la tratamentul cu MZ se produce numai în prezența serului, ceea ce indică că adsorbția componentelor serului poate fi unul dintre mecanismele acțiunii MZ. Adăugarea de EGF la mediul lipsit de ser determină activarea Akt care a fost blocată prin pretratament cu MZ. Adsorbția moleculelor implicate în cascadele de transducție a semnalelor, precum fosfatidele de inozitol și Ca, poate contribui la eficiența terapeutică. Studiile de adsorbție a lipidelor au arătat că MZ contribuie la eficiența terapeutică. Rezultate similare au fost observate la adsorbția proteinelor. Ar putea fi implicate modificările ordinii membranelor și interacțiunile altor proteine cu proteinele de membrană întrucât translocația membranei este necesară pentru activarea protein kinazei B/Akt. A fost arătat că activarea fosfoinozitid-3 kinazei și Akt determină capacitatea celulelor epiteliale transformate de a supraviețui fără legarea celulelor. Activarea constitutivă a fosfoinozitid-3 kinazei în 5 linii de celule de cancere pulmonare ale celulelor mici a determinat creșterea rapidă și independența de ancoraj a celulelor de cancere pulmonare ale celulelor mici. În concordanță cu acestea, tratamentul cu MZ determină inhibiția căilor protein kinazei B/Akt și apoptoza ce urmează. Akt inactivează un inhibitor important de cicline și molecula de supresor tumoral p27^KIP1.
Am demonstrat că tratamentul cu MZ mărește concentrațiile de p21^WAF1CIP1 și p27^K1P1 în modele de celule tumorale. Nu este clar dacă inhibiția Akt este implicată în reglarea expresiei inhibitorilor ciclului celular p21^WAF1CIP1  și p27^KIP1. Rezultatele preliminare arată că MZ adsoarbe și inactivează oxidul nitric și alți oxidanți. În plus antioxidanții stimulează activarea inhibitorului de ciclină p21WAFI/CIP1. Această moleculă este responsabilă de blocarea creșterii celulelor, iar expresia sa în adenocarcinoamele pulmonare este corelată pozitiv cu prognoze optimiste de supraviețuire. Clinoptinolitul activat induce moleculele  de supresori tumorali p21 și p27.