Melidava

Proprietatile antivirale ale extractelor etanolice de propolis impotriva norovirusului si aplicarea acestuia in sucuri proaspete

Spread the love

Romanilor le plac concluziile, deci le dam de la inceput:

„Proprietățile farmacologice ale diferitelor preparate din propolis includ activități antimicrobiene, anticanceroase, antiinflamatoare și de detoxifiere. S-a demonstrat că propolisul și unele dintre componentele sale active pot micșora infectivitatea mai multor virusuri, inclusiv a poliovirusului, virusurilor gripei A și B, reovirusurilor și HIV.

…au fost comunicate numeroase activități ale propolisului, efectele sale împotriva HuNoV (norovirusurile umane) în băuturi…”

Articolul:

Antiviral properties of propolis ethanol extract against norovirus and its application in fresh juices

  1. Liao, L. Sun, D. Wang, L. Chen ș.a.

2021 Elsevier Publishers

Introducere

Norovirusurile umane (HuNoV) sunt virusuri ARN cu o singură bandă în sens pozitiv, non-anvelopate, care aparțin familiei Caliciviridae. HuNoV sunt principala cauză a gastroenteritei non-bacteriene în întreaga lume și sunt împărțite în 10 genogrupuri (G). GI, GII și GIV sunt cauzele cele mai frecvente ale bolilor umane. Din genotipul GII, GII.4 produce majoritatea epidemiilor. Infecțiile cu NoV se produc în principal pe calea fecal-orală, necesitând consumarea de apă sau alimente contaminate, contact direct sau indirect cu persoane infectate, sau contactul cu suprafețe contaminate. HuNoV sunt deosebit de rezistenți la modificările de mediu și prezintă o doză infectivă mică, de aprox. 10 particule virale. Factori de risc în infecțiile norovirale identificați sunt contactul cu pacienți cu diaree și ingestia de alimente nepregătite termic. Alimentele proaspete (legume verzi și tomate, precum și sucurile lor) sunt tipurile de alimente des implicate în infecțiile cu norovirusuri, întrucât se consumă proaspete și sunt puțin procesate, ceea ce mărește riscul de infecție.

Inactivarea HuNoV se efectuează prin tratamentele fizice și chimice tradiționale, care includ încălzire, radiații, hipoclorit de Na și TiO2. Totuși, cele mai multe metode accesibile distrug și componente biologic active (vitamine, compuși antioxidanți) și afectează negativ textura, gustul și culoarea produselor rezultate, cu impact negativ asupra valorii lor nutriționale și senzoriale. Au crescut cererile consumatorilor pentru produse ”verzi” conținând aditivi de origine naturală. Astfel de produse pot înlocui aditivii sintetici și pot fi folosite ca agenți antibacterieni și antioxidanți. Biomoleculele de origine vegetală (terpenoizi, flavonoizi și fenoli) au fost intens studiate ca antioxidanți și conservanți alimentari și au fost incorporate în matricile alimentare sub formă de extracte. Numeroși compuși naturali, inclusiv polizaharide, polifenoli și flavonoizi prezintă activitate antimicrobiană, iar unele sunt cunoscute ca agenți medicinali în prevenirea bolilor virale, fapt demonstrat în teste preclinice și clinice. Unele extracte din plante, precum extractul din semințe de struguri (GSE), din merișoare și din rodii, micșorează infectivitatea NoV în băuturi. Aceste produse naturale prezintă numeroase avantaje și se pot utiliza în siguranță ca medicamente antivirale, întrucât pot fi consumate în siguranță, iar proprietățile lor benefice pentru sănătate au fost mult studiate.

Propolisul este un produs natural de origine vegetală și este folosit drept conservant natural în numeroase produse alimentare. Astfel, prin adăugare în sosuri tradiționale din Turcia și în băuturi lactate poate mări rezistența la oxidare și modifica parametrii de calitate. Este o rășină colectată de către albinele melifere și amestecată cu ceară și alte substanțe. Compoziția sa chimică este complexă și depinde de ecologia regională a plantelor. Materialele din propolis includ în principal acizi și esteri aromatici, aldehide și cetone, steroizi, terpene, aminoacizi, flavonoizi, acizi grași și esterii lor, hidrocarburi, polizaharide, hidroxibenzen și alte componente în cantități mici. Proprietățile farmacologice ale diferitelor preparate din propolis includ activități antimicrobiene, anticanceroase, antiinflamatoare și de detoxificare. A fost demonstrat că propolisul și unele dintre componentele sale active pot micșora infectivitatea a numeroase virusuri, incluzând poliovirusurile, virusurile gripale A și B, reovirusurile și HIV.

În lipsa sistemelor de culturi de celule animale care pot propaga HuNoV, efectele antinorovirus pot fi estimate prin infectivitatea micșorată a surogatelor de HuNoV precum bacteriofagul MS2, norovirusul murinic (MNV) și alte modele in vitro de infectivitate HuNoV. În experimente de rutină, bacteriofagul MS2 poate fi cultivat cu ușurință și economic, iar infectivitatea poate fi determinată mai rapid decât prin alte metode. Norovirusul 1 murinic (MNV-1) este unicul norovirus accesibil în vederea cultivării (genogrupa V) și cel mai potrivit surogat de HuNoV, iar inactivarea HuNoV prin distrugerea capsidei poate fi evaluată prin metoda capturii in situ a QRT-PCR (ISC-qRT-PCR) și poate fi studiată pentru a determina efectele antivirale ale unor substanțe naturale, ale iraderii UV, și ale unor substanțe chimice.

Scopul prezentului studiu a fost evaluarea eficienței extractelor apoase (PWE) și etanolice (PEE) din propolis împotriva norovirusului uman GII.4 și a surogatelor sale MNV-1 și MS2, ca agenți antivirali în industria alimentară, folosind testele standard de infectivitate în plăci și ISC-qRT-PCR. Pentru a studia eficiența antivirală  și mecanismul infectivității PEE asupra infectivității MNV-1, a fost măsurată replicarea virală și adsorbția virusului în celule RAW 264.4 tratate cu PEE în infecția cu MNV-1. În final, a fost stabilită aplicarea PEE drept conservant antiviral natural în sucurile proaspete.

Reactivi, virusuri, bacterii gazdă și linii de celule

Acizii galic, p-cumaric, cafeic, D-glucoza și rutinul au provenit de la Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Shanghai – China). Pinocembrina, acidul benzoic, galangina, α-catechina, epicatechina, chrysina, 3-O-acetatul de pinobanksină ș naringenina au provenit de la BioBioPha Co., Ltd. (Kunming, China). Suspensiile în fecale de NoV GIL.4 au fost achiziționate de la Zhenjiang Provincial Center for Disease Control and Prevention – Hangzhou, China.

Discuții

Informațiile privind proprietățile antivirale ale extractelor din propolis împotriva HuNoV și mecanismele de acțiune, considerând importanța pentru industria alimentară, sunt limitate. Rezultatele noastre au arătat că prin tratarea cu 500µg/mL PEE timp de 30 min., a concentrațiilor virale ridicate (8log10), PEE a fost mai eficient decât PWE în tratamentul MNV-1.

Proprietățile farmacologice ale diferitelor preparate din propolis includ activități antimicrobiene, anticanceroase, antiinflamatoare și de detoxifiere. S-a demonstrat că propolisul și unele dintre componentele sale active pot micșora infectivitatea mai multor virusuri, inclusiv a poliovirusului, virusurilor gripei A și B, reovirusurilor și HIV. Totuși, deși au fost comunicate numeroase activități ale propolisului, efectele sale împotriva HuNoV în băuturi și mecanismul său de acțiune au rămas necunoscute.

În lipsa sistemelor de culturi de celule animale care pot propaga HuNoV, efectele antinorovirus pot fi estimate prin micșorarea infectivității surogatelor de HuNoV precum bacteriofagul MS2, norovirusul murinic (MNV) și alte modele in vitro de infectivitate cu HuNoV. În experimentele de rutină, bacteriofagul MS2 poate fi cultivat ușor și economic, iar infectivitatea poate fi determinată mai rapid decât pentru alte modele. Norovisul 1 murinic (MNV-1) este singurul norovirus cultivabil accesibil (genogrupa V) și este cel mai potrivit surogat al HuNoV. În plus, metoda cu captură in situ QRT-PCR (ISC-qRT-PCR) poate fi folosită pentru a evalua inactivarea HuNoV cauzată de distruerea capsidei și pentru a studia efectele antivirale ale substanțelor naturale, a iradierii UV și ale substanțelor chimice. Deci, ISC-qRT-PCR și testele în plăci au fost folosite pentru a măsura activitățile antinorovirus ale diferiților compuși și a surogatelor HuNoV în acest studiu.

Scopul acestui studiu este evaluarea eficienței extractelor în apă (PWE) și în etanol (PEE) împotriva norovirusului uman GIL-4  și a surogatelor sale (MNV-1 și MS2) drept conservanți naturali alternativi în vederea înlocuirii conservanților artificiali în industria alimentară. Au fost evaluate efectele antivirale ale extractelor din propolis asupra a două surogate de virus enteric uman folosind testele standardizate de infectivitate în plăci și ISC-qRT-PCR. Tendințele dependente de doze și timpi au fost folosite pentru a investiga eficiența antivirală a extractelor din propolis. Pentru a înțelege mecanismul acțiunii PEE aupra infectivității MNV-1, am măsurat replicarea virală și adsorbția virusului în celule RAW 267.4 tratate cu PEE în cursul infecției cu MNV-1. În final, am stabilit aplicarea PEE drept conservant antiviral natural în sucurile de fructe.

  1. Materiale și metode

2.1. Reactivi, virusuri, gazde bacteriene și linii celulare Acizii galic, p-cumaric, cafeic, D-glucoza și rutinul provin de la Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Șanhai, China). Pinocembrina, aidul benzoic, galangina, α-catechina, epicatechina, 3-O-acetatul de pinobanksină, și naringenina provin de la BioBioPha Co.Ltd, (Kunming, China). Suspensiile în fecale de NoV GIL.4 uman au fost achziționate de la Zhejiang Prvincial Center for Disease Control and Prevention din Hangzhiu, China. Escherichia coli (ATCC 155977), bacteriofagul MS2 (ATCC 15597-B1) și MNV și celulele sale gazdă RAW264,7 au fost obținute de la ATCC.

2.2. Prepararea PEE și PWE

Mostra de propolis brut a fost congelată la -20°C timp de 6 ore iar apoi măcinată la pulbere omogenă cu o moară Thomas-Willey. Pulberea (dimensiunea particulelor sub 80 mesh) a fosr depozitată la -20°C până la utilizare. PEE a fost obținut prin metoda următoare; 50g propolis brut au fost măcinate până la pulbere, extrase cu 150mL etanol 96%, sonicată la 25kHz timp de 45 min, iar apoi filtrată la temperatura camerei. PWE a fost preparat după cum urmează; 50g propolis au fost extrase cu 150mL apă la 80°C timp de 12 ore, sonicate la 25kHz timp de 45min, răcite și filtrate la temperatura camerei. Apoi, soluțiile de PEE brut și de PWE au fost centrifugate timp de 15min la 14000g, iar supernatantele au fost concentrate până la uscare sub presiune redusă. PEE a fost dizolvat în 5% DMSO iar PWE a fost dizolvat în apă deionizată pentru a obține soluții stoc de 1000µg/L. Soluțiile de 5% DMSO și apa deionizată care nu conțin propolis au fost folosite ca martori.

2.2. Analiza chimică

Conținutul total de fenoli a fost măsurat în echivalenți acid galic (GAE) folosind metoda Folin-Ciocâlteu și exprimate ca µg acid galic/mg extract. Carbohidrații solubili au fost determinați prin metoda fenol-acid sulfuric cu D-glucoză ca standard. Conținutul de carbohidrați a fost exprimat ca echivalenți glucoză (µg/mg). Concentrațiile totale de flavonizi în extracte au fost estimate printr-o metodă colorimetrică și exprimate ca echivalenți rutin (RE, µg/mg extract).

Analiza chimică a PEE a fost efectuată folosind un detector cu rețea de diode (DAD) pe un sistem HPLC. Mostrele au fost preparate prin diluarea PEE cu etanol 80% (1: 99 v/v). După filtrare, au fost injectați 20µL PEE (15mg/mL) într-un aparat HPLC echipat cu o coloană Agilent Zorbax Eclipse XDB  C18 (150x 4,6mm) cu dimensiunea particulelor de 5µm, o fază mobilă formată din 93% apă/5% metanol/2% acid formic (A) și 3% apă/5% metanol/2% acid formic (B). Eluarea a fost efectuată cu un debit de 1,0mL/min cu un gradient non-liniar (80% A (0min), 60% A (35min), 50% A (35min), 50% A (47min), 20% A (70min) și 80% A (80min). Au fost obținute cromatograme la 270, 290, 320 și 350min. Compușii fenolici din extractele de propolis au fost identificați prin compararea timpilor de retenție și cuantificați ca mg/g propolis, folosind curbe de calibrare cu standardele achiziționate.

2.4. Efecte ativirale ale PEE și PWE

Pentru studiul dependenței de doze, PEE și PWE au fost dizolvate, în concentrații de 1000µg/mL și diluate în condiții aseptice la 100, 250 și 500µg/mL. Volume egale de PEE și PWE au fost amestecate cu volume egale din fiecare virus (MNV-1 sau MS2) pentru a atinge un titru scăzut (4log10 PFU/mL) sau ridicat (8log10 PFU/mL) de numere virale și incubate 30min la temperatura camerei. Pentru studiul dependenței de timp, un set de soluții PEE sau PWE la concentrații de 500µg/mL au fost amestecate cu volume egale din fiecare virus și incubate 0, 10, 20, 30, 40, 50 și 60min. La fel ca fiecare martor netratat, fiecare virus (MNV-1 sau MS2) a fost amestecat fie cu DMSO 5% fie cu apă deionizată. Mediile de cultură de celule (mediu Eagle modificat de Dulbecco, DMEM) conținând 10 ser bovin fetal (FBS) a fost folosit pentru a bloca reacția. Pentru a evalua infectivitatea virusurilor a fost folosit testul standard cu placă. Experimentele au fost replicate de trei ori. Testele de citotoxicitate au fost efectuate folosind diluții decimale al extractelor din propolis pe celule RAW2664.7.

Pentru a evalua infectivitatea HuNoV după expunere la extract din propolis s-a folosit ISC-qRT-PCR. Un volum de PEE sau PWE a fost amestecat cu un volum de HuNoV GIL.4 pentru a obține 4log10 copii/mL (scăzut) sau 8log10 copii/mL (ridicat) și incubate la temperatura camerei timp de 30min. Proprietățile antivirale ale PEE și PWE împotriva HuNoV și recuperarea estiată a ARN-ului non-viral au fost măsurate în modul descris mai departe.

2.5. Stabilirea infectivității MNV-1 și MS2 prin teste pe placă

Infectivitatea MNV-1 și a MS2 a fost determinată folosind un test standard cu placă și comparând cu martorul netratat. Pentru MNV-1 celulele gazdă RAW264,7 au fost încărcate într- placă cu 6 bazine la densitatea de 2 x 106/bazin și incubate până la o confluență de 85-90%. A fost făcută o diluție serială din 10 în 10 în DMEM conținând 10% FBS, iar 0,5mL din diluție au fost inoculați în fiecare bazin al plăcii. Virusurile au fost adsorbite într-un incubator cu CO2 la 37°C timp de 2,5 ore. După adsorbție, a fost îndepărtată inocularea iar celulele au fost acoperite cu 2mL DMEM conținând 1% penicilină-streptomicină, 0,75% agaroză și 10% FBS. Placa a fost incubată timp de 72 de ore, iar apoi acoperită cu un mediu conținând 0,02% roșu neutral. După incubare în roșu neutral timp de 5 ore la 37°C a fost efectuată  numărarea.

Pentru MS2, celulele gazdă de E. coli au fost cultivate în mediu LB la 37°C timp de 8 ore și recoltate prin centrifugare (10 000g timp de un minut), iar apoi peletele de celule gazdă au fost resuspendate în MgSO4 (10mM) și aduse la OD600 de 2.0 (OD600 = 2,0). Celulele suspendate de E. coli (100µL) și 100µL din diluția serială a fagului MS2 au fost adăugați la 3mL de agar LB topit 0,5%, care a fost vortexat și adăugat în partea superioară a mediului conținând 1,5% agar LB. După 12 ore de incubare la 37°C , plăcile cu fagi au fost numărate și s-au calculat titrurile. Scăderile de titru au fost determinate prin scăderea titrului probei tratate cu PEE sau PWE din titrul mostrei martor netratate.

2.6. Stabilirea infectivității norovirusului uman prin ISC-qRT-PCR

Acest test a fost efectuat în modul descris de Wang și Tian. 100µL de soluție PGM ( 1mg/mL în tampon carbonat-bicarbonat 0,5 M pH 9,6)au fost adăugați în bazinele Nune Immuno Modules. Bazinele au fost apoi spălate cu PBS (pH 7,2) și folosite imediat. Au fost preparate modulele ISC-qRT-PCR prin adăugare de 100µL de HuNoV diluați în PBS în fiecare bazin al unui modul și incubare 30min la 37°C. După spălare de trei ori cu PBS, au fost adăugați câte 10µL de dH2O lipsită de RN-ază în fiecare bazin al modulului, care a fost apoi închis cu bandă de poliolefină. Apoi modulele au fost încălzite la 95°C timp de 5 min și răcite la 4°C. ISC-qRT-PCR a fost efectuată pe un sistem ABI 7500 qPCR (Applied Biosystems, CA, SUA) folosind un kit RT-PCR cantitativ, într-o singură treaptă, conform instrucțiunilor fabricantului. Primerul descris și secvențele probă au fost sintetizate cu un moderator modificat și fluorofori. Primerii și probele au fost: (…) și (…). Fiecare reacție a constat dintr-un amestec master qRT-PCR conținând 0,25U transcriptază inversă/polimerază, probe (10nM) și primeri (10nM). Parametrii PCR au inclus transcripția inversă de ARN la 42°C timp de 30min, urmată de o etapă de denaturare la 95°C timp de 2 min., și 40 de cicluri de câte 15 sec la 95°C timp de un minut. La sfârșitul fiecărei etape de extensie a fost detectat un semnal fluorescent. A fost inclus în fiecare serie de amplificare câte un martor negativ (apă). Folosind acest protocol s-a folosit o curbă standard (y = -0,42x + 14,18; R2 = 0,99) pentru a transforma unitățile Ct în numere de copie. Limita de detecție a fost de 0,5 copii de genom.

2.7. Identificarea efectelor PEE asupra adsorbției în celula gazdă a replicării MNV-1 folosind experimente de timp de adăugare

După cum a fost menționat anterior, experimentele de timp-de-adăugare au fost folosite pentru a evalua efectele antivirale ale PEE asupra MNV-1 (-8log10PFU/mL). Pentru a examina efectele tratamentului cu PEE asupra adsorbției MNV pe celulele gazdă RAW264,7 au fost tratate cu PEE atât celulele cât și virusurile. Pretratamentul celulelor RAW264,7 a fost efectuat prin adăugare de PEE (concentrație finală 500µg/mL) la celulele RAW 264,7 și incubare într-un incubator cu CO2 la 37°C timp de 40min. După îndepărtarea mediului de cultură de celule conținând PEE, a fost efectuată o diluție serială de 10 ori a soluției stoc virale (100µL) în DMEM conținând 1,0% penicilină/streptomicină (PS) și 10,0 FBS în fiecare bazin. După adsorbția virusului într-un incubator cu CO2 la 37°C timp de o oră, a fost îndepărtat inoculul și s-a adăugat în fiecare bazin 1mL DMEM conținând 0,5% PS, 1,5% agaroză și 5,0% FBS. Apoi plăcile au fost incubate la 37°C și 5% CO2 timp de două zile. Pretratamentul cu PEE al virusului a fost efectuat prin amestecarea unor volume egale de PEE (concentrație finală 599µg/mL) și MNV-1 și incubare timp de 40min la temperatura camerei. După incubare, tratamentul a fost neutralizat printr-o diluție serială de 10 ori a stocului viral în DME conținând 10% FBS. Diluția virală a fost inoculată într-un monostrat confluent de celule RAW264,7 timp de o oră la 37°C. După adsorbția virusului, a fost îndepărtat inoculul și s-a adăugat în fiecare placă câte 1mL de DMEM conținând 05% PS, 1,5% agaroză și 5,0% FBS. Plăcile au fost apoi incubate la 37°C și 5% CO2 timp de două zile. Pentru testele de cotratament, celulele gazdă RAW264,7 au fost infectate cu stocurile virale și amestecate în același timp cu PEE (concentrație finală 500µg/mL) timp de o oră la 37°C.

Pentru a determina efectul PEE asupra replicării virale au fost efectuate post-tratamente ale MNV-1 cu PEE după cum urmează. Pentru început a fost folosit MNV-1 pentru a infecta celulele RAW264,7 timp de o oră, după carea fost adăugat PEE ( concentrație finală 500µg/mL) timp de 40min la 37°C. După incubare, a fost îndepărtat inoculul amestecat cu PEE iar în fiecare bazin s-a adăugat 1mL DMEM conținând 0,5% PS, 1,56% agaroză și 5% FBS. Apoi plăcile au fost incubate la 37°C și 5% CO2 timp de două zile. S-a folosit apă distilată sterilă ca martor netratat. Prin colorare cu mediul de cultură de celule conținând roșu neutral, iar apoi plăcile după cum a fost descris, au fost observate efectele citopatice și formările de placă.

Aplicarea PEE ca dezinfectant natural al sucurilor de legume

Patru mostre de sucuri proaspete (suc de tomate pH 4,0; suc de lăptuci pH 4,1; suc de struguri pH 3,3; suc de portocale pH 3,5) au fost inoculate manual cu MNV (7,0 log10PFU/mL) și MS2 (7,0 log10PFU/mL) și amestecate cu volume egale de PEE (100, 250 și 500µg/mL). Amestecurile au fost incubate timp de 30min la temperatura camerei. Mostrele martor au conținut sucuri simple (martor pentru citotoxicitate) și sucuri inoculate, fără PEE. Reacția a fost terminată folosind mediul de cultură de celule (DEME) conținând 10% FBS inactivat termic. Fiecare reacție a fost repetată de trei ori, iar stabilirea infectivității MNV-1 și MS2 a fost efectuată în modul descris anterior.

  1. Rezultate

3.1. Compoziția chimică a extractelor din propolis (PEE și PWE) și efectele lor asupra supraviețuirii celulei gazdă

Randamentele de extracție ale PEE ș PWE din propolis au fost 19,87% și 13,11%. Compoziția chimică a extractelor este dată în Tabelul 1. Mostrele de PEE au conținut 151,4 ± 9,74µg GAE/mg fenoli și 70,05 ± 2,56µg RE/mg flavonoizi. Compoziția a confirmat că fenolii au fost principalele componente ale PEE. Dintre acești fenoli, compușii principali au fost galanina, 3-O-acetatul de pinobanksină, pinocembrina și chrysina (Fig. 1). PEE a conținut cantități mai mari de fenoli față de PWE.

PEE și PWE din propolis au prezentat activități antivirale (MNV-1) (Fig S1). Testele de supraviețuire a celulelor au arătat că atunci când PEE și PWE au fost adăugate în concentrații mari la liniile de celule gazdă, s-a observat citotoxicitate față de celulele RAW 264,7 (Fig. S2).

Atunci când concentrațiile de PEE și PWE au fost ˂ 500µg/mL, nu au fost observate efecte citotoxice. Au fost folosite concentrații ˂ 500µg/mL din PEE și PWE pentru testele în placă întrucât nu afectează celulele RAW264,7 ca celule gazdă pentru a măsura efectele antivirale (MNV-1).

3.2. Efecte dependente de concentrații ale PEE și PWE asupra micșorării numerelor de particule virale

După cum arată Tabelul 2, concentrațiile de 100, 250 și 500µg/mL au fost eficiente în micșorarea numerelor de particule virale de HuNoV GIL4, MNV-1 și MS2 în modul dependent de doze. Cantitatea de de genom viral din  grupul cu număr mare a scăzut cu 0,63, 4,70 și 7,05 log10copii/mL la tratarea cu PEE în concentrații de 100, 250 și 500µg/mL. Când HuNoV GIL.4 din grupul cu număr mic a fost tratat cu PWE la 100, 250 și 500µg/mL, cantitatea de genomi nonvirali a scăzut de la 0,97log10copii/mL la nivele nedetectabile. Pentru surogatele de HuNoV, atunci când în grupul cu număr mic, MMNV-1 și MS2 au fost tratați cu PEE la concentrații mici (100µg/mL), au fost observate reduceri de 1,56log pentru MNV-1 și MS2. Atunci când concentrația PEE a crescut la 500µg/mL, infectivitatea MNV-1 și a MS2 a scăzut la nivele nedetectabile. La grupul cu număr mare efectul PEE asupra MNV-1 și MS2 a fost similar cu cel al HuNoV GIL4. Totuși MNV1 și MS2 au fost mai rezistenți la PEE decât HuNoV GIL4.

A fost de asemenea evaluată activitatea antivirală a PWE . Atunci când HuNoV GIL4 a fost tratat cu PWE la 100µg/mL, cantitatea de genomi nonvirali a scăzut cu 0,007l0log10 copii/mL în grupul cu număr mic și cu 0,09log10 copii/mLîn grupul cu număr mare, în comparație cu martori netratați. Întrucât concentrația PWE a crescut la 500µg/mL cantitatea de genomi nonvirali în grupul cu număr mare a scăzut la 2,45log10 copii/mL, iar cantitatea de genomi nonvirali în grupul cu număr mic a scăzut la 2,85log10 copii/mL. Tendințe similare au fost observate la MNV1 și MS2. Totuși, a fost detectată o micșorare la ˂1 log10 PFU/mL a titrului MS2 pentru toate concentrațiile de PWE, atât în grupul cu număr mare cât și în cel cu număr mic. PEE a fost mai eficient în micșorarea inecției HuNoV GIL4, MNV-1 și MS2 decât PWE.

3.3. Efecte dependente de timp ale PEE și PWE asupra micșorării numerelor virale

Dependența de timp a activității antivirale a extractelor din propolis (PEE și PPWE) asupra HuNoV GIL4, MNV-1 și MS2 este arătată în Fig. 2. Extractele din propolis (250µg/mL) au fost incubate cu virusuri timp de 0, 10, 20, 30, 40, 50 și 60min, după care s-a măsurat cantitatea de titru viral și corelată cu timpul de tratament. În grupul martor, numerele virale nu s-au modificat în 60min, în timp ce în grupul PEE tratamentul cu 250µg/mL PEE a micșorat semnificativ numerele virale în modul dependent de timp, Numerele de HuNoV GIL4 au scăzut rapid în primele 30-40min ale tratamentului cu PEE, iar apoi a încetinit la prelungirea timpilor de incubare cu până la 60min. (Fig 2C). S-a realizat o micșorare totală a numărului de HuNoV GIL4 de 4,56log10 copii/mL. Modificarea numerelor virale pentru surogatele de norovirus (MNV-1 și MS2) a prezentat tendințe similare cu cele observate pentru HuNoV GIL4. Acțiunea antivirală a PEE acționează împotriva MNV1 și MS2 în primele 30-40 min de tratament. A fost observată o micșorare importantă de 1,56 și 1,02 log10 PFU/mL a titrurilor MNV-1 și MS2 în primele 10min după amestecarea virusului cu PPE. Titrul continuă să scadă cu 4,27 log10 PFU/mL pentru MNV-1 și 3,41 log10 PFU/mL pentru MS2 în următoarele 30min, și apoi să scadă treptat, lent, pentru restul incubării de 60min.

Norovirusul uman și surogatele sale au fost mai puțin sensibile la PWE decât au fost la PEE. Micșorările totale ale numerelor HuNoV GIL4 MNV -1 și MS2 au fost 1,78 log10 copii/mL și 1,34 log10 PFU/mL prin tratare cu 250µg/mL PWE. Deci PEE are un efect mai mare în micșorarea numerelor de HuNoV GIL4, MNV-1 și MS2 în comparație cu PWE.

3.4. Efectul PEE asupra adsorbției și replicării MNV-1

Am măsurat replicarea virală și adsorbția virusului folosind un experiment cu timp-de-adăugare. Supraviețuirea celulelor RAW 264,7 după tratare cu 500µg/mL PEE a fost ˃ 85% după cum arată Fig. S2. Experimentul cu timp-de-adăugare PEE a fost efectuat la 500µg/mL și nu a fost observată citotoxicitate.

Teste de pretratament și cotratament au evaluat capacitatea extractelor din propolis de a preveni legarea virusurilor la celule. Testele de post-tratament au fost folosite pentru a testa capacitatea extractelor de a preveni replicarea virală. Pretatamentul celulelor cu 500µg/mL de PEE a produs micșorarea titrului de 1,8 log10 PFU/mL în comparație cu martorul. Totuși, pretratamentul MNV-1 cu 500µg/mL de PEE a produs titruri virale de 4,18 log10 PFU/mL, mai mici decât martorul. Cotratamentul (celulele gazdă RAW264,7 au fost infectate cu stocuri virale și amestecate simultan cu 500µg/mL PEE) au cauzat micșorarea titrurilor MNV-1 cu 4,74 log10 PFU/mL în comparație cu martorul. Tratamentul cu 500µg/mL PEE după infecția cu MNV-1 a micșorat titrurile MNV-1 cu 1,37 log10 PFU/mL în comparație cu martorul. Experimentele noastre au arătat că  tratamentul pre-virus și cotratamentul prezintă puternice activități antivirale.

3.6. Activitatea extractelor din propolis în patru sucuri diferite

PEE a demonstrat efecte antivirale împotriva MS2 și a MNV-1 în sucurile testate. Fig. 5 arată micșorarea titrurilor MS2 și MNV-1 în sucurile inoculate de fructe și legume testate după 30min de tratare cu PEE (100, 250 și 500µg/mL) la temperatura camerei. În comparație cu mostrele martor de sucuri netratate au fost observate micșorări semnificative ale infectivității MS2 (0,94, 0,50, 1,18, și 1,09 log10 PFU/mL) după tratarea sucurilor de lăptuci, de tomate, de struguri și de portocale timp de 30min cu 100µg/mL PEE. După tratare cu 250µg/mL PEE micșorarea infectivităților MNV-1 și a MS2 scade în modul dependent de doze. Tratamentul cu 500 µg/mL PEE produce cele mai mari micșorări de infectivitate (5,02log10) în sucul de portocale. La tratarea sucului de struguri cu 500µg/mL PEE, MNV-1 s-a micșorat sub limita de detectare. Titrurile MNV-1 s-au micșorat cu 5,63, 4,04 și 5,03 log10 PFU/mL în sucurile de lăptuci, tomate și portocale. În sucurile testate MS2 pare a fi mai rezistent la PEE decât MNV-1. Activitatea antivirală a PWE în aceste sucuri a fost nesemnificativă.

  1. Discuție

Informațiile privind proprietățile antivirale ale extractelor din propolis împotriva HuNoV și mecanismele de acțiune în legătură cu utilizarea lor în industria alimentară sunt limitate. MNV-1 și MS2 sunt considerate drept surogatele cele mai potrivite ale NoV umane. Rezultatele noastre arată că la tratarea unor încărcături virale ridicate (log10) cu 500µg/m L PEE timp de 30 min, PEE a fost mai eficient decât PWE în micșorarea MNV-1 (6,93 log10 PFU/mL) și MS2 (3,75 log10 PFU/mL), iar încărcările virale mici (4log10) au fost micșorate sub limita de detectare. Am determinat efectul PEE asupra infecției cu HuNoV prin măsurarea capacităților specifice de legare folosindd metoda ISC-qRT-PCR. Activitatea antivirală a PEE asupra HuNoV GIL4 a fost similară cu cea asupra MNV-1 și MS2. Suspensia de HuNoV GL4 cu încărcarea inițială de 7,79log10 copii/mL tratată cu 500µg/mL PEE și-a micșorat genomul viral cu peste 90%.

Rezultatele noastre au arătat și că extractul etanolic din propolis a fost compus în principal din derivați fenolici precum galangina, 3-O-acetatul de pinobanksină, pinocembrină și chrysină. Unii compuși fenolici extrași din produse naturale au fost folosiți pentru a preveni supraviețuirea patogenilor. Schnitzler et al. au investigat componentele propolisului și au comunicat că crizantemum și galangalul (?) au micșorat formarea de placă de către HSV-1 liber cu 56,4% și respectiv cu 68,0% în comparație cu grupul martor netratat. Su și D⸍Souza au comunicat un caz similar al GSE care conținea 3-O-galat de epicatechină, catechine și epicatechine. În studiul nostru, efectele antivirale ale propolisului asupra norovirusului uman și surogatelor sale ar putea fi determinat de compușii fenolici din PEE.

Pentru a stabili modul de acțiune (MOA) al PEE împotriva norovirusurilor au fost studiate efectele tratamentului cu PEE asupra MNV-1 (aprox. 8log10 PFU/mL) la diferiți timpi din cursul infecției (experimentul timp-de-adăugare). Au fost folosite teste de pretratament și cotratament pentru a stabili capacitatea extractelor din propolis de a preveni replicarea virală. Rezultatele obținute sugerează că PEE, la folosire în testele de pre- și cotratament antiviral, prezintă efecte virucide puternice asupra MNV-1. Aceste rezultate au fost confirmate de imaginile TEM ale MNV-1 și MS2  cu și fără pretratament cu PEE. După tratamentul cu PPE proteinele din capsida MNV-1 și MS2 s-au dilatat iar unele au fost denaturate. Deși mecanismele de acțiune pentru efectul antiviral al propolisului nu sunt complet cunoscute, modificările morfologice ale MNV-1 și MS2 observate în studiul nostru au fost similare cu cele suferite de HSV la tratamentul cu flavonoizi (C-glicozil flavonoizi) și de MNV-1 tratat cu ulei de oregano. Gilling et al. au comunicat că caracrolul (ulei de oregano) a fost eficient în a inactiva MNV prin acțiune directă asupra capsidei virale.

În produsele agricole proaspete, există un risc ridicat de contaminare încrucișată între sucurile de legume și cele de fructe. Au existat însă puține evaluări ale aplicării extractelor din propolis drept conservant natural. Pentru a evalua PEE drept conservant natural în băuturi a fost analizată și aplicarea PEE în sucuri proaspete de legume și fructe. Am observat că 500µg/mL PEE au micșorat titrurile MNV-1 și MS2 în sucurile de legume și fructe cu peste 3,0 log10 după 30minute de tratament. Randazzo et al. au găsit că titrurile MNV și HAV din spanac și lăptuci au fost micșorate cu peste 1,5log10 după 30min de tratament cu extract din ceai verde (GTE). Su și D⸍Souza au comunicat de asemenea că după un minut de tratament cu 1mg/mL de GSE, titrurile MNV în sucurile de lăptuci și piper au fost micșorate până la niveluri nedetectabile (sub 0,8 log10) iar titrul HAV a fost micșorat cu 1,23 și respectiv 1,29log10. Rezultatele noastre au fost consistente cu cele din comunicările precedente ale Su și D⸍Souza și Randazzo și al., indicând că PEE poate constitui un candidat pentru obținerea de noi conservanți naturali antivirali pentru sucurile proaspete.

În studiul nostru am demonstrat că extractele din propolis (PEE și PWE) prezintă efecte antivirale împotriva HuNoV GIL4 și a surogatelor sale (MNV-1 și bacteriofagul MS2) și că PEE conținând proporții ridicate de compuși polifenolici a fost mai eficient decât PWE. Considerăm că prezența compușilor fenolici în extractele din propolis constituie principalele ingrediente active.

 

Tabelul 1. Randamentele și compoziția chimică a extractelor din propolis în etanol (PEE) și apă (PWE)

CompozițiePWEPEE
Randament de extracție (%)1,3 ± 0,6419,87 ± 5,43
Conținut total de fenoli (µg GAE/mg)20,05 ± 2,56151,54 ± 9,74
Conținut total de flavonoizi (µg RE/mg)14,62 ± 0,6570,05 ± 2,56
Carbohidrați soubili (µg Glc/mg)338,43 ± 7,32ND

 

Crazy mad chemist holding test tube with his successful experiment in laboratory.

#Melidava #MelidavaRomania #maimultdecatsanatate #polen #polencrud #naturavie #alimentfunctional

O descoperire remarcabila pentru apicultura, nutritie si apiterapie, a constituit-o polenul crud.
Pana in urma cu cativa ani, in apiterapie se utiliza doar polenul uscat, cum era in mod obisnuit furnizat de apicultura.
In Martie 1992, Patrice Percie du Sert, inginer agricol si apicultor pasionat din Franta, era intr-o stare alterata de sanatate datorita muncii extenuante. Medicul i-a spus ca nu mai poate continua la fel ca pana atunci.
Cum albinele incepusera recoltarea polenului, atras de culorile placute si proaspete ale granulelor, s-a lasat purtat de dorinta de a-l gusta pentru prima oara direct din colector.
Cititi mai multe aici:

https://melidava.com/informatii-pentru-sanatate/pastura-cruda-polen-crud/polen-crud-aliment-functional-si-probiotic/
...

Lasati un comentariu:

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *