Melidava

Extracte naturale, miere si propolis ca inhibitori ai norovirusului uman

Romanilor le plac concluziile, deci le dam de la inceput:

„Până acum nu există informații insuficiente pentru a trata o infecție cu norovirus, iar vaccinurile și antiviralele sunt încă în faza clinică și de dezvoltare”

Articolul

Natural extracts, honey and propolis as human norovirus inhibitors

1. Ruoff, J. M. Devant, G. Hansman

Scientific Reports 2022, 12.8116

Norovirusurile umane produc o boală acută cu febră, grețuri, vomismente, crampe și diaree, care persistă de obicei timp de 2-5 zile. Norovirusurile sunt extrem de contagioase, iar 10-100 particule virale pot fi suficiente pentru a infecta un individ. US Centers for Disease Control and Prevention estimează că aceasta este cea mai frecventă cauză a gastroenteritei acute în SUA cu 21 milioane de cazuri, 70 000 spitalizări și 800 decese anual. În întreaga lume infecția cu norovirus produce aprox. 20% din din bolile însoțite de diaree și 200 000 de decese infantile în fiecare an, iar numărul de cazuri necomunicate este ridicat. Infecțiile cu norovirus se pot produce la toate grupele de vârstă și produc morbiditate și mortalitate semnificative, în special la pacienții foarte bătrâni și foarte tineri. Măsurile de prevenire împotriva acestor infecții includ spălarea mâinilor, izolarea celor infectați, curățenie și dezinfecție minuțioase.

Norovirusurile au un genom cu o singură bandă, sens pozitiv, de ARN de 7,4-7,7 kbaze. Genomul conține trei cadre cu citire deschisă (ORF), din care ORF1 encodează proteine non-structurale, care includ proteaze și ARN polimeraza dependentă de ARN (RdRp), ORF2 encodează proteina capsidei (VP1), iar ORF3 encodează o proteină structurală minoră. Pe baza secvenței de aminoacizi a capsidei, norovirusurile se împart în cel puțin 10 genogrupe (G1-GX) dintre care GI, GII și GIV cauzează infecții ale oamenilor. Fiecare dintre aceste genogrupe se subdivide în numeroase genotipuri. Norovirusurile umane evoluează adeseori în tulpini variante genetic și antigenic, iar recombinările genetice frecvente ale RdRp și joncțiunei capsidei măresc diversitatea genetică și antigenică.

Expresia genei capsidei în celulele insectelor produce autoasamblarea de particule de tip viral (VLP) similare antigenic cu virionii nativi cu simetrie icosaedrică T = 4, dar au fost observate și particule cu T = 3 și mai mici cu T = 1. VLP GIL10 prezintă atât simetrie icosaedrică T = 3  cât și T = 1. Structura din cristalografie cu raze X a VLP norovirusurilor a identificat două domenii: scoică (S) și proeminent (P). Domeniul S înconjoară ARN-ul viral, iar domeniul P (care poate fi împărțit în subdomeniile P1 și P2) conține determinanți pentru legarea și antigenitatea cofactorilor.

Norovirusurile se leagă de cofactori antigenilor de grupe histo-sangvine (HBGA), care sunt structuri polimorfice de carbohidrați ce se găsesc ca antigeni liberi în salivă și pe suprafețele diferitelor epitelii. HBGA pot fi de tip ABH sau Lewis și în cel puțin nouă cofactori diferiți ai HBGA care se leagă la norovirusuri. Tipurile ABH se caracterizează printr-o legătură α-L-fucoză-(1-2)-β-D-galactoză, în timp ce tipurile Lewis conțin o α1-fucoză-(1-3)/(1-4)-β-D-N-acetil-glucozamină. Norovirusurile GII interacționează cu ABH-fucoză, fucoză Lewis sau o combinație a acestora. Studiile timpurii ale structurilor au arătat că norovirusurile leagă două molecule de HBGA per dimer din domeniul P, iar norovirusurile GI și GII leagă HBGA în diferite regiuni ale capsidei. Noi am identificat două buzunare suplimentare de legare a fucozei pe capsida de norovirus GII, ceea ce sugerează că interacțiunile de legare HBGA sunt mai complexe decât se cunoștea anterior. Atât norovirusule epidemice cât și cele rar detectate leagă mai multe tipuri de HBGA.

HBGA și buzunarele de legare a fucozei de pe capsida norovirusurilor constituie ținte pentru compușii antivirali. Unii compuși care se leagă la buzunarul HBGA, precum oligozaharidele din lapte matern (HMO), citratul și moleculele care se suprapun buzunarului HBGA, de ex nanocorpii specifici norovirusurilor și un anticorp monoclonal specific norovirusului. Alte studii au descoperit anticorpi monoclonali specifici norovirusurilor care pot inhiba legarea HBGA. Identificarea unor astfel de compuși care blochează legarea HBGA constituie tratamente potențiale ale infecției cu norovirus. Unele studii au examinat potențialul de a bloca HBGA al unor extracte naturale, ca de ex. bila chinezească, sucul de rodii, acidul tanic, sucul de merișoare, extractul din sâmburi de struguri, extractul din curmal japonez, și extractele din ceai verde. Aceste extracte targetează buzunarul HBGA și contituie terapii promițătoare cu compuși naturali.

În acest studiu am evaluat diferite extracte naturale (sirop din flori de cocos, sirop de curmale, nectar de agave, sirop de mere, lăptișor de matcă, malț de orz, sirop de arțar), 10 mostre diferite de miere și 4 mostre de propolis cu scopul de a identifica inhibitori care blochează legarea VLP GIL4 și GIL10 ale norovirusurilor la HBGA. Tratarea VLP cu aceste mostre produce o distrugere a integrității VLP și produce agregări de particule. Rezultatele noastre au indicat că atât legarea genotipurilor epidemice cât și a celor rar detectate la HBGA poate fi blocată de propolis și de siropul de curmale.

Rezultate

Tratamente cu extracte naturale

A fost examinată capacitatea a 7 extracte naturale de a bloca legarea GII.4 epidemic și a norovirusului G2.10 rar detectat de HBGA folosind ELISA (Fig.1). Siropul de curmale a blocat atât legarea VLP  GII.4 cât și a VLP GII.10 de HBGA la concentrații mici (IC50 = 0,06% și respectiv 0,l1%). Siropul din flori de cocos și cel din mere au inhibat slab GII/4 VLP (IC50 = 5,84% și 14,96%), dar nu și GII.10 VLP. Aceste trei extracte au prezentat inhibiții dependente de doze. Mai multe extracte naturale au prezentat proprietăți de legare neobișnuite la VLP GIL.4, malțul de orz, lăptișorul de matcă și nectarul de agave au prezentat efecte de inhibiție negativă la concentrații mici. La concentrații mai mari de 0,78% malțul de orz a inhibat VLP GIL.4 (IC50 = 0,90%). Această neobișnuită inhibiție GIL.4 cu malț de orz a fost observată și în testele de inhibiție 2FL.

Pentru a evalua modul în care extractele naturale modifică stabilitatea VLP ale norovirusului intact au fost măsurate diametrele VLP tratate cu extracte naturale folosind DLS. VLP ale GIL.4 și GIL.10 netratate au produs un singur pic, indicând o mostră omogenă cu diametre VLP de aprox. 40-46nm (Fig. 2). Pentru GIL.4 incubarea cu sirop de măr, sirop de agave și sirop de arțar a arătat că dimensiunile VLP au fost comparabile cu cele ale VLP netratate. Florile de cocos, siropul de curmale, lăptișorul de matcă și malțul de orz au amplificat GII.10, tratamentele cu sirop de mere, sirop de agave și sirop de arțar au fost comparabile cu VLP netratate. Florile de cocos au produs o ușoară creștere a heterogenității VLP, iar siropul de curmale, lăptișorul de matcă și malțul de orz au amplificat heterogenitatea GIL.10 VLP și au produs o deplasare mărită a picului.

Pentru a observa direct efectele și a le compara cu măsurătorile DLS, extractele naturale au fost incubate cu VLP și examinate folosind EM (Fig. 3) Morfologia VLP GIL4 netratate a constat în principal din particule T = 4, iar VLP GIL4 tratate cu suc de mere, sirop de agave și malț de orz au fost comparabile cu VLP GIL4 netratate. Cu flori de cocos, sirop de curmale și malț de orz VPL GIL4 au fost găsite în agregate mici și mari. Pentru lăptișor de matcă au fost observate VLP singulare dar o mare parte din grida EM conținea bastonașe lungi și subțiri, care proveneau din mostra de extract natural. Rezultatele EM sunt în acord cu măsurătorile DLS și au confirmat că unele extracte naturale produc agregarea și aglomerarea VLP.

Tratamentul cu miere

Au fost examinate 10 mostre diferite de miere pentru a evalua capacitatea lor de a bloca legarea norovirusurilor VLP GIL.4 și GIL.10 la HBGA (Fig. 4). Mostrele de miere au inhibat VLP GIL.4 și GIL.10 cu valori IC50 de 4,72-24,77% și respectiv 3,38-15,26%. Pentru VLP GIL.4 mostrele de miere cu cele mai mici concentrații IC50 au fost cele de zmeură (IC50 = 4,72%), mierea de pădure din Alpi (IC50 = 4,78%), mierea de stejar (IC50 = 5,85%) și cea de eucalipt (IC50 = 6,22%). Pentru VLP GIL.10 au fost observate date similare, astfel mierea de pădure din Alpi (IC50 = 3,38%), mierea de zmeură (IC50 = 5,60%), mierea de eucalipt (IC50 = 5,96%) și mierea de stejar (IC50 = 6,11%). Experimentele numai cu solvent au produs rezultate similare cu martorii PBS (nici un tratament) ceea ce a indicat că solvenții nu afectează inhibiția. Aceste date arată că mostrele de miere cu diferite origini herbale și regionale pot bloca VLP ale coronavirusurilor la diferite concentrații și similar între două genotipuri. Am evaluat de asemenea tratamentul cu miere asupra stabilității VLP folosind DLS (Fig. 5). Toate mostrele de miere au produs modificări notabile ale diametrelor VLP GIL.4 și GIL.10 și s-a observat o creștere a heterogenității și o deplasare a picului. Tratamentul cu miere Robinia a fost ușor diferit între VLP GIL.4 și GIL.10, GIL.10 prezentând o creștere mai mare a heterogenității în comparație cu VLP GIL.4. Pentru a observa direct aceste efecte, VLP tratate cu miere au produs gruparea VLP GIL.4 și GIL.10 în agregate mici, deși au fost observate și particule singulare. Aceste rezultate sugerează că VLP sunt înclinate către agregare și rămân în cea mai mare parte intacte.

 Extracte naturale blocând atașarea VLP GIL.4 și GIL.10 la HBGA. VLP au fost amestecate cu extracte naturale diluate serial și s-a măsurat nivelul de inhibiție a legării HBGA folosind ELISA. Concentrația finală ma extractelor naturale a fost de 12,5-0,l01%. Toate experimentele au fost efectuate în triplicat, iar deviația standard este arătată prin bare de eroare iar întreruperile IC50 prin linie punctată. Pentru VLP GIL.4 siropul de curmale a prezentat cea mai puternică inhibiție (IC50 =0,06%) urmat de malțul de orz (IC50 = 0,9%). Toate celelalte extracte naturale au prezentat potențiale mici de blocare la concentrațiile testate.

(B) Pentru VPL GIL.10 siropul de curmale a inhibat legarea la HBGA la concentrații mici (IC50 = 0,11%), iar celelalte extracte naturale nu au fost eficiente la concentrațiile testate.

Extracte naturale și măsurători DLS ale VLP GIL4 și GIL10. Măsurătorile DLS au au fost folosite pentru a evalua dimensiunea hidrodinamică a VLP (măsurată prin intensitate) după tratamentul cu extracte naturale. (concentrație finală a extractelor 12,5%) la 10, 60 și 120 min (reprezentate prin linii de culoare închisă, medie și deschisă) . VLP netratate (linia neagră) prezintă un singur pic pentru toți timpii. (A) Pentru GIL4, tratamentul cu suc de mere, sirop de agave și sirop de arțar au avut efecte minore asupra diametrelor. Pentru siropul din flori de cocos și cel de curmale, diametrele VLP GIL4 au fost mai mari decât pentru VLP netratate. Pentru lăptișor de matcă și malț de orz, au fost detectate două noi picuri VLP GIL4 cu diametre mai mari. (B) Pentru GIL10 tratamentul cu sirop de mere și sirop de agave al VLP nu a produs diametre mai mari. Siropul de curmale, din flori de cocos și lăptișorul de matcă au mărit diametrele VLP GIL10, iar pentru malțul de orz au fost observate două picuri reprezentând diametre mărite ale VLP. Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat și sunt prezentate măsurători reprezentative.      

Tinctura de propolis – Melidava

Tratament cu propolis

Au fost examinate patru mostre diferite de propolis pentru a stabili capacitatea lor de a bloca VLP ale norovirusurilor de a se lega de HBGA (Fig. 7). Mostrele de propolis au arătat o inhibiție dependentă de doză, iar VLP ale GIL4 și GIL10 au fost blocate la concentrații mici cu valori IC50 de 0,44-5,38%. Cea mai puternică inhibiție a fost observată la extractul din propolis în etanol 96%, cu GIL4 (IC50 = 0,44%) și GIL10 (IC50 = 0,57%). O diferență mică a nivelelor de inhibiție a fost observată la extractele în DMSO; GIL 4 (IC50 = 1,74%) și GIL10 (IC50 = 5,38%). Am evaluat și efectele tratamentului cu propolis asupra stabilității VLP ale GIL4 și GIL10 folosind DLS (Fig. 8). Aproape toate mostrele de propolis au mărit heterogenitatea și au determinat deplasări ale picurilor de 100-1000nm, chiar la timpi mici (10min) de incubare. O mostră de propolis, extractul în 20% PEG200 a avut un efect mic asupra VLP GIL10, iar pentru VLP GIL4 a fost observată o modificare a diametrului și heterogenității. Pentru a observa direct efectele, VLP ale GIL4 și GIL10 tratate cu propolis au fost examinate folosind EM (Fig. 9). Trei dintre mostrele de propolis (DMSO, PEG200 și EtOH 70%) au produs agregarea VLP în aglomerări, deși au fost observate și particule intacte. În cazul mostrei de extract în etanol 96% din propolis au fost observate agregate mari de VLP dezasamblate și foarte puține particule intacte.

Discuție

Un studiu recent care a folosit un sistem de cultivare a celulelor de norovirus, în care au fost folosiți enteroizi umani pentru propagarea virusului, a arătat că un anticorp monoclonal specific norovirusului a inhibat virionii norovirusului în culturi de celule. Autorii au mai observat că agregarea VLP a norovirusului (măsurată folosind DLS) s-a produs la tratare cu anticorpul monoclonal și au sugerat că VLP ar putea reticula, ceea ce blochează steric la rândul său zona de legare a HBGA. Totuși, anticorpul monoclonal nu se leagă direct la buzunarul HBGA iar amprenta sa a fost localizată în partea laterală a domeniului P. O observație similară a fost făcută pentru mai mulți nanocorpi specifici norovirusuluui. Studiile de inhibiție folosind extracte naturale, precum sucul de rodie, sucul de merișoare și extract din ceai verde, au indicat diferite nivele ale inhibiției HBGA, deși zona de legare la capsidă rămâne necunoscută. Alte mostre naturale, precum citratul și HMO au arătat că aceste molecule se leagă la buzunarul HBGA al capsidei, ceea ce a blocat legarea VLP de HBGA.

Până acum nu există informații insuficiente pentru a trata o infecție cu norovirus, iar vaccinurile și antiviralele sunt încă în faza clinică și de dezvoltare. Din punct de vedere terapeutic, cei mai mulți indivizi infectați ar favoriza posibilitatea de a micșora simptomele grave, care pot include vomismente abundente, grețuri, febră și diaree. Norovirusul este extrem de contagios, iar virionii sunt stabili pentru perioade lungi de timp. Metodele de dezinfectare includ albitorii cu clor și peroxid de hidrogen. Dezinfectanții pe bază de alcool au produs concluzii amestecate și sunt considerați o ultimă linie de apărare.

Extracte naturale și analiza EM a VLP GIL4 și GIL10. EM de colorare negativă a fost folosită pentru a evalua integritatea VLP după tratamentul cu extracte naturale (concentrația finală a extractelor 12,5%). Cu lăptișor de matcă, formele de bastonaș alungit (mostra cu RJ) au acoperit vizualizarea VLP tratate. Imaginile pentru VLP GIL.4 tratate cu siropurile de agave și de arțar au fost asemănătoare cu cele ale VLP netratate. Tratamentul cu sirop de mere și malț de orz a produs formarea de mici agregate. Tratamentul cu sirop din flori de cocos și cel cu sirop de curmale a determinat formarea de agregate VLP GIL4 mai mari. (B). VLP GIL10 netratate au prezentat o combinație între VLP T=1 și T=3. VLP GIL10 tratate cu sirop din mere au semănat cu VLP netratate. VLP GIL10 tratate cu siropurile de arțar, din flori de cocos și malț de orz au determinat formarea de agregate mici. VLP GIL10 tratate cu sirop de agave și cu sirop de curmale au format agregate mai mari. Sunt prezentate imagini semnificative.      

Pentru scopuri practice, albirea cu clor și peroxid de hidrogen necesită de obicei închiderea zonelor contaminate, care poate include zone ale spitalelor, școli, vase de croazieră și cămine pentru bătrâni. Un domeniu important al infecțiilor cu norovirus este contaminarea alimentelor, care a devenit o problemă importantă în întreaga lume, iar decontaminarea  alimentelor este o prioritate pentru agricultură și industria de prelucrare a produselor oceanice. Descoperirea unui tratament inhibitor sigur și natural este benefică și de mare interes. Metodele de decontaminare utilizate până acum includ iradierea UV, dezinfectanții chimici, și presiunea înaltă.

În acest studiu am arătat că siropul de curmale a fost cel mai puternic inhibitor al VLP GIL4 (IC50 = 0,06%) și GIL10 (IC50 = 0,11%) ale norovirusului folosind ELISA, fapt confirmat la folosirea DLS și EM. Malțul de orz a arătat un potențial de inhibiție ceva mai scăzut față de VLP GIL.4 (IC50 = 0,90%) fapt confirmat la folosirea DLS și EM, în timp de în cazul norovirusului GIL10 malțul de orz a avut un efect slab la concentrațiile testate. Mostrele de miere au fost mai puțin eficiente în blocarea legării VLP GIL.4 și GIL.10 la HBGA în comparație cu siropul de curmale, deși tratamentul a produs agregarea VLP. Toate mostrele de propolis au prezentat potențial de inhibiție a VLP GIL.4 și GIL.10, în special extractul în etanol 96% (IC50 = 0,44% și IC50 = 0,57%), fapt confirmate prin DLS și EM. Rezultatele noastre au fost comparabile cu cele ale tratamentelor cu citrat și nanocorpi care au arătat că integritatea VLP ale norovirusului a fost compromisă, iar modificările de morfologie au inclus dezasamblarea și agegarea particulelor. Tratamentul cu alte extracte naturale a produs rezultate similare. Astfel, tratamentul cu extract din sâmburi de struguri a produs deformarea și mărirea particulelor. Mai multe studii care au folosit surogate de norovirus (calcivirus felin și norovirus murinic) au arătat de asemenea că fructele naturale sauu componente ale acestora pot inhiba sau micșora infectivitatea.

Metode

Extracte naturale, miere și propolis

Au fost achiziționate 7 extracte naturale (sirop de curmale, malț de orz, sirop de mere, nectar de agave, sirop din flori de cocos, lăptișor de matcă și sirop de arțar), 10 mostre diferite de miere (pădure alpină, de coriandru, eucalipt, brad I și II, de Mexic, flori de portocal, stejar și Robinia) și două mostre de propolis (MF și tinctură) din diferite surse (Tabelul 1). Mostrele de extracte naturale și de miere au fost diluate în PBS (pH 7,4), filtrate (0,45µM) și depozitate la 4°C. MF de propolis a fost măcinat și apoi incubat în trei solvenți diferiți, PEG200 20%,  DMSO 100% sau etanol 70%. Aceste mostre de propolis au fost lăsate timp de 30 de zile la temperatura camerei, iar apoi au fost limpezite prin centrifugare și filtrare (dimensiunea porilor 0,45µm), iar soluția finală a fost depozitată la 4°C. Tinctura de propolis a fost achiziționată gata de folosire în etanol 96%. Au fost pregătiți martori cu solvenți (PEG200, DMSO și etanol) în concentrații comparabile cu cele ale mostrelor diluate de propolis, pentru a asigura că inhibiția efectelor de agregare nu a fost cauzată de solvenți.

Propolis mielat – Melidava

Măsurătorile pentru mostre de miere și VLP GIL.4 și GIL.10. DLS au fost folosite pentru a evalua dimensiunea hidrodinamică a VLP (concentrație finală de miere 12,5%) la 10, 60 și 120min. Pentru toate mostrele de miere s-a produs o creștere a diametrelor VLP. (A) Pentru tratamentul VLP GIL.4 cu brad I și II, coriandru, Robinia, pădure alpină, stejar, de Mexic și din flori de portocal au fost observate deplasări similare ale picurilor. Tratamentul cu eucalipt și zmeură a produs un pic aplatizat și un domeniu mai mare de agregate VLP GIL.4 de diferite dimensiuni. (B) Pentru tratamentul VLP GIL.10 a fost observat un model similar, cu excepția că VLP GIL.10 tratate cu zmeură și eucalipt au produs două picuri de dimensiuni mai mari. Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat și sunt prezentate măsurătorile cele mai semnificative.

Fig. 6. Analiza EM a VLP GIL.4 și GIL.10 a mostrelor de miere. A fost observată prin EM integritatea VLP după tratamentul cu diferite mostre de miere (concentrația finală a mierii 12,5%). (A) Pentru GIL.4, cele mai multe mostre de miere au făcut ca VLP să formeze mici agregate, în special brad II, stejar și zmeură. (B) Pentru GIL.10, VLP din tratamentul mostrelor de miere tind să formeze agregate, în special brad I, coriandru, de Mexic, și eucalipt, deși au fost observate și particule singulare.

Expresia VLP.

VLP1 ale norovirusului pentru două genotipuri GII diferite, GIL.4 (Sydney 2012) și GIL.10 (Vietnam 026) au fost expresate în celule de insecte, agregate în pelete prin ultracentrifugare și apoi purificate folosind ultracentrifugare în gradient de CsCl.

Teste de blocare a HBGA

Testele de blocare au fost efectuate folosind o metodă descrisă anterior pentru HMO. 96 de plăci cu bazin au fost acoperite cu mucină gastrică de tip III de porc (PGM), spălate de trei ori cu PBS conținând 0,1% Tween 20 (PBS-T) și apoi blocate cu 5% lapte degresat în PBS. Concentrațiile VLP GIL.4 și GIL.10 netratate au fost optimizate prin legare la PGM. VLP GIL.4 (1µg/mL) sau VLP GIL.10 (10µg/mL) au fost amestecate 1:1 cu extracte diluate serial (începând de la concentrația de 25%) timp de 3 ore la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate de trei ori cu PBS-T, iar apoi 100µL din fiecare amestec VLP/extract natural au fost adăugați în bazinele triplicate timp de 2 ore la temperatura camerei. După spălare, 100µL anticorp de iepure policlonal specific genotipurilor GIL.4 sau GIL.10 au fost adăugați ca anticorp de detecție primară timp de o oră la temperatura camerei. După o etapă de spălare, fost adăugat anti-iepure policlonal conjugat cu peroxidază din hrean (HRP) sau streptavidină conjugată cu HRP în bazine, și incubat o oră la temperatura camerei. Toate plăcile au fost spălate și developate cu diclorhidrat de o-fenilendiamină (OPD) și H₂O₂ la întuneric pentru 30min la temperatura camerei. Reacția a fost stopată cu HCl 3N și a fost măsurată absorbanța la 490nm (OD₄₉₀). Martori negativi, VLP fără inhibitor și fără VLP au fost folosite pentru toate plăcile. Valoarea OD₄₉₀ a VLP netratate a fost stabilită ca valoare de referință corespunzătoare la o legare de 100%. Concentrațiile diferitelor extracte au fost definite ca 100% pre-diluție. Proporția de inhibiție a fost calculată ca /1-(VLP tratat medie OD40/referință medie OD490)/ x 100. IC50 a fost determinată folosind softul Prism (versiune 8.0). Toate experimentele au fost efectuate cu trei replicate și s-au calculat media și deviația standard.

Propolis drop falling.

Mostre de propolis blocând atașarea VLP GIL.4 și GIL.10 la HBGA. VLP au fost amestecate cu mostrele diluate de propolis (100% DMSO, 20% PEG200, etanol 70%, etanol 96%) și a fost măsurată inhibiția legării la HBGA folosind ELISA. Concentrația finală a extractelor din propolis a fost de 25-0,02% (concentrațiile finale de solvenți: DMSO 25-0,02%, PEG200 5-0,004%, etanol 70%: 17,5-0,014%, și etanol 96% 24-0,0192%). Toate mostrele de propolis au prezentat inhibiții dependente de doze; (A) Pentru VLP GIL.4 a fost observată cea mai mică concentrație de inhibiție la propolis în etanol 96% (IC50 = 0,44%). (B) Pentru VLP GIL.10 a fost observată cea mai mică concentrație de inhibiție la extract cu etanol 96% din propolis (IC50 = 0,57%).

Dispersia dinamică a luminii.

Au fost analizate diametrele hidrodinamice ale VLP folosind dispersia dinamică a luminii (DLS) cu un Zetasizer Nano S (Malvern). VLP (1mg/mL) au fost amestecate (1:1) și incubate timp de 10, 0 și 120min la temperatura camerei, diluate într-un mL de apă distilată și apoi măsurate. Pentru mostrele de propolis, o soluție de lucru 25% a fost lăsată 48 de ore la 4°C și apoi centrifugată pentru a elimina ceara precipitată. Măsurătorile de intensitate au fost efectuate la 25°C în trei serii cu 15 cicluri de măsurare.

Microscopie electronică

VLP (tratate și netratate) au fost analizate folosind microscopie electronică cu colorare negativă (EM). Un stoc de extracte naturale sau de miere, cu concentrația de 25% a fost amestecat (1:1) cu 1mg/mL VLP și incubat o oră la temperatura camerei (concentrația finală a probelor cu extracte naturale sau cu miere = 12,5%). Mostrele de propolis au fost preparate la fel cu DLS. Mostrele au fost diluate 1:40 în apă distilată și încărcate imediat în gride EM acoperite cu carbon. Gridele au fost spălate cu apă distilată, colorate cu acetat de uranil 0,75% și apoi examinate cu un microscop electronic Zeiss 900. Imaginile EM au fost analizate pentru fiecare probă și este arătată cea mai reprezentativă.

Măsurătorile GIL.4 și GIL.10 de propolis și DLS. Au fost folosite DLS pentru a evalua dimensiunea hidrodinamică a VLP (concentrație finală de propollis12,5%, concentrații finale de solvenți: DMSO 12,5%, PEG200 2,5%, etanol 70% 8,75% iar etanol 96% 12%) la 10,60 și 120 min (reprezentate prin linii ușor, mediu și închis colorate). VLP netratate au prezentat un singur pic (linia neagră). VLP tratate cu propolis în 100% DMSO, cu 70% etanol 8,75% și cu 96% etanol au prezentat deplasări similare ale picurilor pentru (A) GIL.4 și (B) GIL.10. Tratamentul propolisului cu PEG200 a prezentat o deplasare a picului pentr VLP GIL.4, deși mai puțin pronunțată decât în cazul celorlalte mostre de propolis, iar pentru VLP GIL.10, mostra în 20% PEG200 a prezentat numai o deplasare minoră de pic. Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat și sunt prezentate măsurătorile reprezentative.

Analiza EM și a propolisului ale VLP GIL.4 și GIL.10. A fost folosită EM cu colorare negativă pentru a determina direct integritatea VLP. Pentru ambele: (A) GIL.4 și (B) GIL.10, tratamentul cu propolis în 100% DMSO, propolis în etanol 96% și propolis în 20% PEG200 (concentrația finală de propolis 12,5%, concentrațiile finale de solvenți DMSO 12,5%, PECG200 2,5%, etanol 70% 8,75% și etanol 90% 12%) a produs agregate de VLP, în timp ce pentru propolis în etanol 70% au fost observate VLP singulare.

Tabelul 1. Descrierea pentru mostrele de extracte naturale, miere și propolis

Albina la propolis