

Activitatea antimicrobiana a propolisului sarbesc
Antimicrobial activity of Serbian propolis evaluated by means of MIC, HPTLC, Bioautography and Chemometrics
Ristivojevic, I. Dimkic, J. Trifkovic, T. Beric, I. Vovk, D. Milojkovic-Opsenica, S. Stankovic
PLOS ONE/DOI: 10.1371journal pone 0157097, 7 iunie, 2016
NOTA: am publicat acest articol pentru ca evident activitatea propolisiului romanesc este similara cu a celui sarbesc. Doar ca la noi nu prea prezinta interes…
ABSTRACT
Au apărut noi informații despre activitățile biologice ale propolisului și calității produselor naturale, care necesită o metodă de evaluare rapidă și exactă precum amprentarea HPTLC (Cromatografie de înaltă performanță în strat subțire). Studiul investighează abordările cromatografice și chemometrice de determinare a activității antimicrobiene a propolisului din Serbia împotriva unor specii de bacterii. Pentru a extrage informațiile relevante din amprentele cromatografice a fost folosită o tehnică de calibrare liniară cu mai multe variabile, prin tehnica celor mai mici pătrate, pentru a indica picurile ce reprezintă compuși fenolici care determină capacitatea antimicrobiană a mostrelor. În plus, bioautografiile directe au localizat activitatea antibacteriană pe cromatograme. A fost determinată ctivitatea biologică a mostrelor de propolis împotriva speciilor de bacterii prin testul concentrației inhibitorii minime, care a confirmat afilirea lor la tipul european de propolis de plop și au relevat existența a două tipuri (albastru și oranj) conform originii botanice. Cea mai puternică activitate antibacteriană a avut mostra 26 împotriva Staphylococcus aureus cu o valoare MIC de 0,5 mg/mL și Listeria monocytogenes cu MIC 0,1 mg/mL, care a fost și cea mai mică concentrație eficientă observată în studiu. În general, tipul oranj de propolis a prezentat o activitate antimicrobiană mai mare decât tipul albastru. Modelarea PLS a fost efectuată folosind datele HPLC iar modelele rezultate pot indica calitativ componentele cu rol important în activitatea mostrelor de propolis. Picurile cele mai relevante care influențează activitatea antimicrobiană a propolisului împotriva tuturor tulpinilor de bacterii au fost cele ale compușilor fenolici la valori Rf de 0,37, 0,40, 0,45, 0,51, 0,60 și 0,70. Cunoștințele astfel acumulate sunt importante pentru atribuirea activității antimicrobiene a propolisului unor anumite componente și verificarea amprentării HPLC ca metodă de identificare a componentelor care pot determina activitatea antimicrobiană. Aceasta este prima comunicare asupra activității propolisului din Serbia determinată prin metode combinate, inclusiv prin modelarea activității antimicrobiene prin amprentare HPTLC.


Taking closer look…
Introducere
Propolisul este o substanță lipicioasă, colectată de albine (Apis mellifera L.) din mugurii plantelor, în funcție de zona de climă. Este folosit de către albine ca clei, pentru a astupa crăpăturile stupului și ca barieră de protecție împotriva microorganismalor, șoarecilor, șerpilor, etc. Folosirea sa ca antiseptic și antipiretic datează din antichitate în numeroase culturi, egipteni, incași, greci, romani și slavi. A fost recunoscut oficial ca medicament în Farmacopeia Londrei din sec. al 17-lea și este mult folosit și astăzi în zona balcanică. Recent, au fost investigate componentele și proprietățile sale biologice în legătură cu abordarea etnofarmacologică prin proprietățile sale antiseptice și imunomodulatoare. Abordarea etnofarmacologică, combinată cu metode chimice și biologice, poate furniza elemente farmacologice utile. Compoziția chimică a propolisului depinde de originea sa geografică, de flora locală, specia de albine și anotimp. În general, propolisul este compus din 50 % rășini vegetale, 30 % ceară, 10% uleiuri esențiale și aromatice, 5 % polen și 5 % diferite alte substanțe. Una dintre funcțiile propolisului în stup este protecția împotriva pătrunderii microorganismelor. Sunt bine studiate efectele antimicrobiene ale propolisului împotriva bacteriilor, drojdiilor, virusurilor și paraziților.
Unele proprietăți farmacologice ale propolisului – antioxidant, antibacterian, antiviral, antifungic și anti-inflamator – au fost atribuite componentelor sale fenolice. Au fost elaborate diferite tehnici analitice precum spectrometria în ultraviolet/vizibil, cromatografia în strat subțire (TLC), electroforeza, HPLC, HTPLC și spectrometria de masă, pentru a analiza componentele fenolice din mostrele de propolis. Profilul fenolic al propolisului din Serbia a fost determinat în detaliu prin HTPLC și UHPLC-LTQ Orbi Trap MS/MS, folosind analiza multivariată de imagini și metode de recunoaștere a modelului, care au revelat existența a două varietăți, oranj și albastru, caracteristice pentru propolisul european de plop.
Se pot folosi tehnici de modelare multivariate (studiul statistic al datelor atunci când se efectuează măsurători multiple pentru fiecare unitate experimentală și sunt importante conexiunile între măsurătorile multivariate – cu variabile multiple – și structurile lor. Au fost descrise mai multe tehnici de calibrare liniară multivariată, precum regresia liniară multiplă (MLR), regresia componentei principale (PCR) și regresia parțială a celor mai mici pătrate (PLS), pentru predicția activității antioxidante a ceaiului verde și a speciilor de Mallotus și a capacității de proliferare a limfocitelor pentru Panax ginseng. Pentru identificarea componentelor bioactive din extractele brute a fost descrisă o metodă microbiologică de screening corelată cu tehnici cromatografice, denumită bioautografie.
Articolul de față este o continuare a evaluării comprehensive a propolisului din Serbia și a propolisului european de plop, în vederea modelării activității antimicrobiene a acestor mostre de propolis prin amprentele lor fenolice HPTLC și a indicării picurilor, a componentelor care determină capacitatea lor antimicrobiană. Până acum, nu au fost publicate modelări ale activității antimicrobiene folosind amprentarea. Efectul antimicrobian asupra speciilor de bacterii a fost determinat prin MIC. A fost efectuată bioautografia directă pentruu a localiza pe cromatograme activitatea antibacteriană. Aceasta este prima comunicare asupra activității antimicrobiene a propolisului din Serbia, determinată prin metode combinate.
Materiale și metode
Reactivi și materiale
2-Aminoetil difenil borinatul (NTS) a fost cumpărat de la Fluka (Steinheim – Germania), toluenul și acetatul de etil de la Merck (KIGaA, Darmstadt – Germania), polietilen glicolul (PEG) și metanolul de la Sigma –Aldrich (Steinheim – Germania) și acidul formic de la Kemika (Zagreb – Croația). Standardele de compuși fenolici precum quercetina, apigenina, kaempferolul, rutinul, myricetina, chrysina, luteolina, pinostrobina, pinobanksina și naringenina au fost cumpărate de la Fluka AG (Buch – Elveția) iar acizii p-cumaric, cafeic, ferulic și galic de la Sigma-Aldrich (Steinheim – Germania). Filtrele-seringă (13 mm, membrană PTFE de 0,45 µm) au fost cumpărate de la Supelco (Bellefonte – SUA). Au mai fost folosite o soluție apoasă de resazurină (concentrație finală 0,675mg/mL) ca sare de sodiu C12H6NNaO4 (TCI – Belgia) și o soluție de bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT) cu 0,2% bromură de tiazolil blue tetrazoliu C18H16BrN2S (Sigma-Aldrich, SUA) cu 0,1% Triton X-100 (C14H22O (C2H4O)n (Sigma-Aldrich, SUA).
Mostre de propolis
A fost folosit un total de 53 mostre de propolis colectate din diferite regiuni ale Serbiei în anii 2010 și 2011 folosind metoda cu răzuire și depozitate la -20oC înainte de analiză. Toate mostrele au fost colectate din stupi de Apis mellifera L (Tabelul SLT). Extractele metanolice din mostrele de propolis au fost preparate conform metodei descrise anterior. Nu au fost necesare permisiuni specifice ale autorităților pentru locațiile sau activitățile implicate. Apicultorii au furnizat mostrele de propolis luate în studiu. Studiul nu a implicat specii periclitate sau protejate.
Tulpini bacteriene și condiții de dezvoltare
Activitatea antibacteriană a fost testată folosind două tulpini Gram negative (I) Aeromonas hydrophila (ATCC 49140) și Shigella flexneri (ATCC 9199) și mai multe tulpini Gram pozitive (II) Listeria monocytogenes (ATCC 19111), Bacillus subtilis ATCC 6633, Enterococcus faecalis ATCC 29212 și Staphylococcus aureus ATCC 25923. Screeningul inițial al activității antibacteriene a fost efectuat folosind alte 5 tulpini Gram negative; (I) Enterobacter cloacae (ATCC 49141), Escherichia coli (ATCC 25922), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15422) și Salmonella enteridis (ATCC 13076) și 2 tulpini Gram pozitive (II) Micrococcus luteus (ATCC 7468) și Streptococcus equisimilis (ATCC 12394). Tulpinile de bacterii au fost ținute peste noapte la 37oC în MHB (mediu Muller-Hinton, HiMedia, India) cu excepția L. monocytogenes cultivată în mediu BHI (Brain-Heart Infusion, Biomedics, Spania). Suspensiile au fost aduse la turbiditatea standard McFarland (0,5) care corespunde la 107-108 CFU/mL.


Microbiology bacteria laboratory work
Teste antibacteriene
Screeningul inițial al activității antibacteriene ale mostrelor de propolis a fost efectuat prin metoda difuziunii în disc la 13 tulpini de bacterii Gram pozitive și Gram negative. Plăcile Petri cu mediu solid MHA (agar Muller-Hinton) au fost acoperite cu 5 mL de mediu moale MHB, inoculat anterior cu 50µL din tulpina indicator. Testul prin difuziune a fost completat prin adăugarea de propolis testat la diferite concentrații (1,5 – 0,01 mg/disc) în discul de 5mm (Abtek Biologicals, Anglia). Plăcile Petri au fost incubate timp de 24 ore la 37oC. Reazultatele au fost obținute prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție și exprimate în min. Toate experimentele au fost triplicate.
A fost folosită metoda prin microdiluție de mediu pentru a determina concentrațiile inhibitoare minime și bactericide minime (MBC) ale mostrelor de propolis testate. Concentrațiile finale ale mostrelor de propolis în primul bazin au fost de 7 – 20 mg/mL, în funcție de mostră. Concentrația finală de metanol ca solvent a fost de 10%. Au fost efectuate diluții seriale de câte două ori cu mediu MHB în plăci de microtitrare cu bazine de 96, cu excepția L. monocytogenes pentru care s-a folosit mediu BHI. În afară de martorul negativ au mai fost testate și un martor de sterilitate, un martor al solventului (metanol), antibioticele streptomicină, ampicilină și rifampicină au fost testate ca martori poztivi. Toate diluțiile au fost efectuate în duplicat. Fiecare bazin, cu excepția celui martorului de sterilitate, a fost inoculat cu 20 µL de cultură bacteriană (aprox. 1 x 108 UFC/mL) atingând un volum final de 200 µL. La final, au fost adăugați 22 µL de resazurină în fiecare bazin. Plăcile au fost incubate timp de 24 ore la 37oC. Toate testele au fost efectuate în medii luminate însă plăcile au fost incubate la întuneric. Resazurina este un indicator de oxidare-reducere folosit pentru evaluarea creșterii celulelor. Este un colorant albastru, non-fluorescent, non-toxic, care devine roz și fluorescent când este redus la resorufină de către oxidoreductazele din celulele viabile. Cea mai mică concentrație la care nu s-a modificat culoarea a fost considerată MIC. MBC a fost determinată prin sub-cultivarea diluțiilor test din fiecare bazin fără modificări de culoare pe plăci de agar și incubate timp de 18 – 24 ore. Cea mai miică concentrație care nu a prezentat dezvoltare bacteriană a fost definită ca valoare MBC. Rezultatele sunt exprimate în mg/mL.
Cromatografie în strat subțire de înaltă performanță și bioautografie
Metoda HPTLC folosită pentru obținerea de profile fenolic ale mostrelor de propolis a fost descrisă anterior. În același timp au fost cromatografiate în aceleași condiții etaloanele de fenoli.
Pentru a prepara plăcile HPTLC pentru bioautografie, au fost aplicați câte 2 µL de extract din propolis pe plăci 10 x 10 cm F254 de sticlă cu silicagel HPTLC 60 (Art. 5641, Merck, Darmstadt, Germania) în benzi de 8 mm folosind un Automatic sampler TLC 4 (ATS4, CAMAG, Mutten, Elveția). Developarea a fost efectuată la o distanță de 8 cm pe o cameră de developare orizontală (CAMAG) folosind 6 mL dintr-un amestec de n-hexan-acetat de etil – acid acetic (5:3:1). Plăcile developate au fost uscate în curent de aer cald, urmat de o variantă de bioautografie cu acoperire, variantă modificată a metodei Valgas et al. Pe fundul plăcii spre capete a fost pusă banda de autoclavă, formând o adâncitură de 10 x 10cm, cu adâncimea de 0,5 cm. Plăcile HPTLC cu mostre au fost sterilizate timp de 15 min. sub lumină UV. Agar moale MHB sau BHI (2 mL) inoculat anterior cu 70µL (1 x 108 UFC/mL) din bacteriile testate au fost dispersate pe plăci. Plăcile HPTLC de silicagel 60, 20 x 10 cm, au fost așezate în cutii din material plastic cu ghemotoace de vată pentru menținerea umidității la incubare, timp de 24 ore la 37oC, la întuneric. După incubare, plăcile au fost stropite cu MTT 0,2% pentru a vizualiza zonele de inhibiție, iar apoi incubate timp de 3-4 ore.
Colectarea datelor și analiza statistică
Imaginile plăcilor au fost procesate cu programul http://image.nih.gov./ii/ver, 1,k47q.l Rasband W. National Institutes of Health, SUA. Ordonarea datelor și tehnicile de analiză a imaginilor au fost descrise într-un articol anterior. Regresia PLS a celor mai mici pătrate a fost efectuată folosind PLS Toolbox v. 6.2.1. de la MATLAB 7.12.0 (R2011a). PLS este o metodă de regresie cu mai multe variabile care calculează noi variabile latente (LV) pentru matrici variabile independente (X) și dependente (Y) și legătura dintre ele. Variabilele latente prezintă variații mari, bine corelate cu Y, iar numărul lor optim se determină prin validare încrucișată. Contribuția variabilelor în modelul final poate fi interpretată prin evaluarea coeficienților lor de regresie.
Rezultate și discuții
Amprentarea HPTLC a fenolilor din mostrele de propolis din Serbia a revelat existența a două tipuri principale de propolis diferite botanic; un tip oranj, caracterizat prin benzi oranj intens și albastru și zone verde-pal, și un tip albastru, cu un profil chimic încărcat cu benzi albastre, confirmat prin aplicarea unor tehnici diferite de recunoaștere. Mostrele de propolis oranj au prezentat profile cromatografice identice, diferit de tipul albastru pentru care compoziția în fenoli diferă între mostre. Tipul oranj este prevalent.
Activitatea antimicrobiană a extractelor din propolis
Activitatea antimicrobiană a mostrelor de propolis din Serbia a fost testată inițial împotriva a 13 tulpini de bacterii. Pentru screeningul primar s-a folosit metoda difuziunii în disc. A fost testată sensibilitatea mostrelor de propolis împotriva a 7 bacterii Gram negative (A. hydrophila, E. cloacae, E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa, S. enteridis și S. flexneri) și 6 bacterii Gram pozitive (B. subtilis, E. faecalis, S. equisimilis, M. luteus, S. aureus și L. monocytogenes).
Efectul antimicrobian cel mai puternic împotriva A. hydrophila și S. flexneri l-au prezentat mostrele 10, 17, 28, 29 și 30, cu apariția zonelor de inhibiție la 0,05mg/disc și diametre mai mari de 12 mm. Cea mai puternică activitate împotriva bacteriilor Gram pozitive a fost arătată de mostrele 7, 8, 9, 17, 19, 28, 29, 32 și 51. Cea mai mică activitate MIC a fost de 0,01 mg/disc, în special împotriva L. monocytogenes, S. aureus, E. faecalis și B. subtilis. Cel mai puternic efect a fost observat împotriva B. subtilis și L. monocytogenes, cu o zonă de inhibiție mai mare de 12 mm, la concentrații de la 0,15 mg/disc. Mostrele 1, 2, 3, 4 și 6 de propolis au prezentat activitate antimicrobiană moderată împotriva tulpinilor testate (zone de inhibiție de 8 – 12mm) începând de la 0,10 mg/disc pentru bacteriile Gram negative. O A. cloacae a fost sensibilă numai la aceste 5 mostre. Mostrele 9, 11, 12, 15, 16, 17, 19, 28, 29, 30 32 și 51 de propolis nu au inhibat E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa și S. enteridis la nici o concentrație. Activitate față de E. coli a fost decelată la mostrele 7, 8 și 10 la concentrații mai mari (0,20 – 1,5 mg/disc). Activități similare pentru mostrele 7, 8 și 10 au fost obținute împotriva M. luteus și S. equisimilis, care, altfel au fost cele mai rezistente dintre tulpinile Gram pozitive. Mostrele 11, 12, 15, 16, 17, 19, 28, 29, 30, 32 și 51de propolis nu au avut efect împotriva M. luteus, iar mostrele 11 și 19 au fost active împotriva S. equisimilis numai la concentrații mai mari.
Valorile MIC și MBC ale celor 53 mostre de propolis au fost determinate pentru fiecare bacterie. Ca tulpini indicatoare aui fost folosite cele cu cea mai mare sensibilitate în screeningul primar: B. subtilis, E. faecalis, S. aureus, L. monocytogenes, A. hydrophila și S. flexneri. Valorile MIC sunt date în Tabelul 1 iar valorile MBC în Tabelul S2. Deși citirile spectrometrice la o anumită lungime de undă sunt mai obiective și mai ușor cuantificabile, datorită sedimentării continue a mostrelor reacția cu resazurină a fost folosită pentru a determina activitatea antimicrobiană a propolisului. În primul bazin s-a folosit metanol drept martor negativ pentru fiecare tulpină indicatoare și nu a avut nici un efect asupra creșterii la concentrația finală (10%).
Tabelul 1. MIC pentru extractele metanolice din mostrele de propolis din Serbia (mg/mL)
Extracte din propolis | Tipul de propolis | Aeromonas hydrophila | Shigella flexneri | Listeria monocy-togenes | Staphylo-coccus aureus | Bacillus subtilis | Enteroco-ccus faecalis |
Sensibilitatea bacteriilor Gram pozitive la propolis a variat în funcție de tulpinile testate, iar activitatea antimicrobiană a fost evaluată prin reacția cu resazurină. În primul bazin a fost folosit metanol ca martor negativ pentru fiecare tulpină indicatoare, și nu a arătat nici un efect asupra dezvoltării la concentrația finală de 10%.
Sensibilitatea la propolis a bacteriilor Gram pozitive a variat în funcție de tulpinile testate și mostrele de propolis folosite, dar toate tulpinile testate au fost sensibile la toate mostrele de propolis. Cea mai mare activitate antimicrobiană a fost produsă de tulpina 26 împotriva S. aureus cu MIC 0,5mg/mL și L. monocytogenes cu MIC 0,1 mg/mL, care a fost și cea mai mică concentrație eficientă observată. Mostrele 34, 36, 44 și 46 de propolis au prezentat de asemenea o activitate ridicată împotriva tuturor bacteriilor Gram pozitive cu valori MIC de 0,3 – 2,2 mg/mL. Toate aceste mostre au aparținut tipului oranj de propolis, caracterizat prin conținutul ridicat de compuși fenolici. Tulpina Gram pozitivă cea mai sensibilă a fost L. monocytogenes cu MIC 0,1 – 1,9 mg/mL pentru propolisul oranj și 0,4 – 10,6 mg/mL pentru propolisul albastru. Valorile MIC ale extractelor din propolis din Grecia și Cipru testate pe două tulpini de L. monocytogenes conform Kalogeropoulos et al. au fost 0,08 – 0,30 mg/mL, confirmând sensibilitatea acestor tulpini. Mostrele de propolis colectate din diferite regiuni din Turcia au prezentat activitate antimicrobiană împotriva L. monocytogenes. Restul bacteriilor Gram pozitive testate; B. subtilis, E. faecalis și S. aureus MIC a fost 0,3 – 10 mg/mL, fără legătură cu tipul de propolis folosit.
În ceea ce privește bacteriile Gram negative testate, toate mostrele de propolis au avut un oarecare efect, dar valorile MIC au fost mai mari în comparație cu cele pentru bacteriile Gram pozitive (MIC 0,3 – 16,8 mg/mL). Nu a fost observată o ordonare a mostrelor de propolis din cele două varietăți. Valoarea MIC cea mai mică a fost 0,3 mg/mL pentru A. hydrophila obținută cu mostrele 34 și 46, fiind cea mai mică concentrație activă împotriva bacteriilor Gram negative. A fost decelată o activitate antimicrobiană slabă împotriva bacteriilor Gram negative la mostrele 7, 8, 9, 11, 16, 19, 23, 38 și 51 în special împotriva A. hydrophila. Activitatea antimicrobiană a propolisului împotriva A. hydrophila a fost confirmată și de alți autori, însă valorile MIC au fost mai mari decât cele din prezentul studiu.
Tulpina cea mai rezistentă testată în acest studiu a fost S. flexneri cu valori MBC de peste 10 mg/mL, pentru 47 mostre de propolis (Tabelul S2). În afară de efectul puternic al mostrei 26 (MIC 2,0 mg/mL împotriva S. flexneri, numai extractele 10 și 17 au prezentat valori MIC relativ mici, 1,8 și 1,4 mg/mL. Rezultatele au fost confirmate de un studiu care a comunicat că o tulpină de Shigella dysenteriae a fost cea mai rezistentă dintre toate bacteriile Gram negative testate. Recent, Lou et al. au comunicat că E. coli, Salmonella typhimurium și S. dysenteriae au fost sensibile la acid p-cumaric.
După Pepeljniak și Kosalec mostrele de propolis cu conținut ridicat de galangină prezintă valor MIC și MBC mai mici, iar Mercan et al. au comunicat că chrysina este antimicrobiană iar la concentrații mari inhibă bacteriile Gram negative. Ristivojevc et al. au comunicat că subgrupa oranj de propolis este mai bogată în galangină, chrysină și pinocembrină față de subgrupa albastră. Extractele obținute de noi au prezentat cele mai mici activități antimicrobiene pentru mostrele 5 și 15, cu valori MIC și MBC mai mari de 12,0 mg/mL. Aceste mostre au aparținut subgrupei albastre de propolis cu conținut mai mic de compuși fenolici.
Tipul oranj de propolis are activitate antimicrobiană mai mare decât tipul albastru datorită conținutului mai mare de compuși fenolici. Propolisul oranj a prezentat activitate mai mare decât cel albastru la testare împotriva L. monocytogenes (tcr = 1,67; t = 5,57), B. subtilis (t = 3,94), E. faecalis (t = 2,37) și S. flexneri (t = 2,97).
Deși proprietățile antimicrobiene ale propolisului au fost mult investigate, rezultatele diferitelor studii nu pot fi comparate datorită compozițiilor variabele a extractelor și metodelor diferite de evaluare a activității antibacteriene a propolisului. Stepanovic et al. au analizat activitatea antimicrobiană a propolisului din Serbia și, fără detalii privind compoziția chimică a mostrelor investigate, au arătat că valorile MIC pentru bacteriile Gram negative au fost mai mari decât cele pentru bacteriile Gram pozitive. Numeroși autori au arătat că efectul antimicrobian a fost mai pronunțat împotriva bacteriilor Gram negative față de cele pentru bacteriile Gram pozitive. În structura pereților celulari ai bacteriilor Gram pozitive predomină peptidoglicanii, ceea ce permite moleculelor hidrofobe să pătrundă în celule și să acționeze împotriva pereților și a membranelor celulare precum și în citoplasmă. Pereții celulari ai bacteriilor Gram negative au o compoziție mai complexă, cu mai puțini peptidoglicani și cu membrana exterioară compusă din distraturi de fosfolipide legate de membrana interioară prin lipopolizaharide. Membrana exterioară este practic impermeabilă pentru moleculele hidrofobe deși unele pot traversa lent prin porine (proteine compuse din folii β și benzi β legate între ele prin tururi β pe partea citoplasmică. Benzile β sunt orientate antiparalel și formează tuburi cilindrice denumite β-barrels. Sunt implicate în transportul pasiv al moleculelor hidrofile cu diferite dimensiuni și sarcini electrice prin membranele celulare, permițând intrarea nutrienților și substratelor și evacuarea toxinelor și reziduurilor. Reglează permeabilitatea și previn lizarea prin limitarea pătrunderii detergenților). Compușii fenolici prezintă activități antimicrobiene împotriva bacteriilor Gram negative. Efectele lor depind de concentrațiile la care pot interfera cu enzimele în producerea de energie și pot denatura unele proteine. Borges et al. au arătat că acizii fenolici (ferulic, galic) afectează membranele celulare ale bacteriilor Gram pozitive și negative producând modificări ale hidrofobicității și sarcinilor suprafețelor celulare, iar – în consecință – producând scurgeri a conținutului citoplasmic. Derivații acidului cafeic produc efecte similare asupra membranelor celulare ale tulpinilor de Candida.
Amprentarea TLC
Datorită prevalenței tipului oranj de propolis în Serbia și activității sale antimicrobiene superioare, au fost efectuate și alte evaluări cromatografice și multivariate pe baza datelor obținute pentru acest tip de propolis.
Activitatea antimicrobiană a varietății oranj de propolis a fost estimată și prin bioautografiere directă. Plăcile TLC de silice developate au fost cufundate într-o suspensie din microorganismele analizate crescute în mediile potrivite, care au făcut din suprafața plăcii o sursă de nutrienți care permite dezvoltarea. Zonele de inhibiție a microorganismelor au format spoturi albe-crem în locurile care conțineau agenți antimicrobieni. Un test de bioautografie pentru fiecare bacterie, împreună cu cromatograma HPTLC a mostrei 26 de propolis sunt prezentate. Bacteriile testate au prezentat sensibilități diferite la compușii antimicrobieni din mostrele de propolis, fiecare tulpină având un profil de bioautografie caracteristic. Activitatea antimicrobiană a mostrelor de propolis a fost asociată cu cele mai abundente componente care prezintă valori Rf de 0,40 – 0,70.
Fig. 1. Test de bioautografie al mostrelor de propolis împotriva a 6 tulpini de bacterii. (A) Profilul fenolic al extractului de propolis; (B) E. faecalis; (C) B. subtilis; (D) S. aureus; (E) L. monocytogenes; (F) A. hydrophila; (G) S. flexneri
Tabelul 2. Parametri statistici pentru 6 modele de PLS
Tulpina bacteriană | LV | RMSEC | RMSECV | Coeficient de regresie negativă |
Coeficienți de regresie ale modelelor PLS obținute pentru 6 tulpini de bacterii
Rezultate anterioare au arătat influența componentelor fenolice (acid cafeic, galangină, quercetină, naringenină, pinostrobină și chrysină) asupra activității antimicrobiene a propolisului. Substanțele au fost asociate cu benzi prin comparare cu cromatogramele TLC ale etaloanelor de componente fenolice obținute în aceleași condiții cromatografice. Influența componentelor minore din propolis, cu valori Rf de 0,53 – 0,55 nu trebuie neglijată întrucât ele prezintă activitate ridicată împotriva bacteriilor B. subtilis, E. faecalis, S. aureus, L. monocytogenes și A. hydrophila. Conform autobioautografiei pentru S. aureus se observă un efect sinergic între componentele cu Rf 0,50 și 0,60.
Cu scopul de a evalua dependențele dintre parametrii care determină activitatea antimicrobiană a propolisului a fost efectuată o modelare PLS a datelor HPTLC. În acest scop, au fost folosite profilele cromatografice obținute pe plăci de amino-silicagel, datorită numărului mare de benzi abrupte, eficiențelor mai bune de separare și zgomotelor de fond neglijabile. Cromatograma HPTLC a propolisului oranj împreună cu o cromatogramă a unui amestec standard obținută pe plăci cu silicagel pentru a putea fi comparate cu profilul fenolic al propolisului este prezentată în S1 Fig. Componente precum acidul cafeic (Rf = 0,37), quercetina/luteolina (Rf = 0,40), apigenina/acidul p-cumaric/kaempferolul (Rf = 0,45), naringenina/pinobanksina (Rf = 0,51), compusul necunooscut 1 (Rf = 0,60) și compusul necunoscut 2 (Rf = 0,70) au fost identificate ca markeri caracteristici pentru varianta oranj de propolis.
Matricea folosită pentru modelarea PLS a constat din 42 mostre și 450 variabile, exprimate ca valori ale intensității pixelilor de-a lungul segmentelor de dreaptă obținute prin digitizarea cromatogramelor. Modelele rezultate pot fi folosite pentru a indica componentele fenolice cu cea mai mare influență asupra activității antimicrobiene a fiecărei mostre de propolis, dar nu și pentru predicția ei adecvată datorită calității statistice nesatisfăcătoare a modelelor. Picurile care determină activitatea antimicrobiană a mostrelor de propolis pot fi marcate în funcție de coeficienții de regresie ai modelului. Picurile cromatografice cu coeficienți negativi de regresie corespund componentelor care prezintă caracteristici antibacteriene, iar valorile MIC scad odată cu creșterea activității.
Modelele PLS obținute pentru legătura dintre activitatea antimicrobiană (MIC ca variabilă dependentă) și profilul HPTLC (valori Rf, ca variabile dependente) separat pentru 6 tulpini sunt date în Tbelul 2. Numărul de variabile latente (LV) a fost selectat pe baza valorilor minime ale RMSECV și a diferenței minime între valorile RMSEC și RMSECV. Picurile incluse în modelele finale ale activității antimicrobiene sunt prezentate în Tabelul 2 în ordinea descrescătoare a coeficienților de regresie, cu notificarea asupra semnificației contribuției lor la variabila dependentă.
Profilul de amprente HPTLC și reprezentările grafice liniare ale cromatogramelor și un grafic al coeficienților de regresie din modelele PLS sunt date în Fig. 2.
Picurile cele mai relevante care influențează activitatea antimicrobiană a propolisului împotriva tuturor tulpinilor de bacterii au corespuns componentelor fenolice cu valori Rf de 0,37, 0,40, 0,45, 0,51, 0,60, 0,70 și 0,77. Aceste benzi au cele mai mari valori negative ale coeficienților de regresie confirmând rezultatele bioautografiilor. Quercetina singură (banda oranj intensă la Rf 0,40 în cromatogramele TLC inhibă semnificativ dezvoltarea S. aureus, B. subtilis și A. hydrophila. Totuși, în combinație cu CAPE, activitatea quercetinei scade, sugerând un antagonism care ar putea constitui motivul micșorării activității împotriva S. flexneri, L. monocytogenes și E. faecalis. Singulară, quercetina (banda oranj intensă la valoarea Rf de 0,40 pe cromatograma TLC; Fig. 2) a inhibat semnificativ dezvoltarea S. aureus, B. subtilis, și A. hydrophila. Conform Boisard et al. pinocembrina, 3-O-acetatul de pinobanksină, chrysina și galangina,k izolate din extractele din propolis, prezintă activitate antibacteriană moderată împotriva S. aureus. Modelul PLS al acestei tulpini bacteriene arată picuri dominante la Rf 0,37, 0,40, 0,51 și 0,60, urmate de picuri la Rf 0,45 și 0,77. Picul de la Rf 0,30 este de asemenea important, iar un pic la Rf 0,60 cuprinde mai multe benzi cromatografice, confirmând rezultatele bioautografiei, importanța zonelor din vizibilul mic de pe TLC și efectele sinergice dintre componente. În cazul B. subtilis, a fost urmărită motilitatea bacteriei în prezența fenolilor, iar efectul inhibitor scade în ordinea: CAPE ˃ quercetină ˃ naringenină ˃ acid cafeic. O diagramă de regresie obținută pentru B. subtilis arată importanța picurilor la valori Rf de 0,37 (acid cafeic), 0,45 (apigenină/acid p-cumaric/kaempferol) și 0,51 (naringenină/pinobanksină), legătura dintre picurile la valori Rf de 0,52 și 0,60, și apariției unui nou pic la Rf 0,70 (care nu apare la alte tulpini de bacterii), confirmând rezultatele publicate anterior. Componentele cu activitate antimicrobiană împotriva A. hydrophila au fost recunoscute ca picuri la valori Rf 0,37, 0,40, 0,60 și 0,77. Conform literaturii, quercetina (Rf = 0,40) și acidul cafeic (Rf = 0,37) au fost identificați ca agenți antimicrobieni împotriva A. hydrophila. O serie de picuri suprapuse în domeniul valorilor Rf 0,15 – 0,30 sugerează existența unui număr mare de componente cu activitate antimicrobiană scăzută. Vectorii de regresie pentru E. faecalis corespund benzilor la valori Rf 0,45 și 0,77. Picuri fără determinare clară au fost obținute în domeniul valorilor Rf 0,37 – 0,40. Graficele de regresie pentru S. flexneri și L. monocytogenes au arătat absența componentelor antimicrobiene sub valoarea Rf 0,37, contrar tulpinii A. hydrophila și numeroase picuri suprapuse în restul cromatogramei. Quercetina și esterii săi nu prezintă activitate semnificativă asupra S. flexneri date confirmate de investigațiile asupra mostrelor de propolis, date de asemenea confirmate. O publicație anterioară a subliniat activitatea antimicrobiană ridicată a acidului cafeic și quercetinei împotriva L. monocytogenes, contrar impactului lor moderat în mostrele de propolis din Serbia. După Merkl et al. acizii fenolici și esterii lor sunt agenți antimicrobieni împotriva L. monocytogenes, în acord cu rezultatele noastre.
Concluzii
Utilizarea HPTLC, MIC și bioautografiei pentru analiza amestecurilor complexe de produse naturale – precum propolisul – devine esențială. Integrarea cu tehnici de chemometrie face posibilă indentificarea componentelor care determină capacitatea antimicrobiană. …
#Melidava #MelidavaRomania #maimultdecatsanatate #polen #polencrud #naturavie #alimentfunctional
O descoperire remarcabila pentru apicultura, nutritie si apiterapie, a constituit-o polenul crud.
Pana in urma cu cativa ani, in apiterapie se utiliza doar polenul uscat, cum era in mod obisnuit furnizat de apicultura.
In Martie 1992, Patrice Percie du Sert, inginer agricol si apicultor pasionat din Franta, era intr-o stare alterata de sanatate datorita muncii extenuante. Medicul i-a spus ca nu mai poate continua la fel ca pana atunci.
Cum albinele incepusera recoltarea polenului, atras de culorile placute si proaspete ale granulelor, s-a lasat purtat de dorinta de a-l gusta pentru prima oara direct din colector.
Cititi mai multe aici:
https://melidava.com/informatii-pentru-sanatate/pastura-cruda-polen-crud/polen-crud-aliment-functional-si-probiotic/